Biosynthese von Silbernanopartikeln durch Leishmania tropica

Die Leishmaniose ist eine parasitäre Erkrankung, die von 20 verschiedenen Leishmania-Arten ausgelöst wird. Leishmaniose wird aus 88 Ländern gemeldet; schätzungsweise 350 Millionen Menschen weltweit sind dem Risiko ausgesetzt, sich mit einer Form der Krankheit zu infizieren, und 12 Millionen sind infiziert, bei einer jährlichen Inzidenzrate von etwa 1,5 bis 2 Millionen. Nach Schätzungen der WHO treten 90 % der kutanen Fälle in sechs Ländern auf. Je nach Erreger und genetischem Hintergrund des Wirts zeigt die Leishmaniose unterschiedliche Erscheinungsformen, von einer selbstheilenden Läsion bis hin zu einer tödlichen systemischen Form der Krankheit. Die beiden häufigsten klinischen Formen der Krankheit, die kutane Leishmaniose (CL) und die viszerale Leishmaniose (VL), kommen vor allem in 14 der 22 Länder der Region Östliches Mittelmeer (EMRO) vor (Postigo, 2010). Traditionell werden Leishmania-Parasiten direkt durch mikroskopische Untersuchung klinischer Proben nachgewiesen. In einem Endemiegebiet lässt sich die CL jedoch im Allgemeinen allein anhand ihres klinischen Erscheinungsbildes diagnostizieren (Kaur et al., 2003). Die Nanotechnologie ist die Lehre von der Kontrolle der Materie im atomaren und molekularen Maßstab. Im Allgemeinen befasst sie sich mit Strukturen, die in mindestens einer Dimension 100 nm oder kleiner sind, und umfasst die Entwicklung von Materialien oder Geräten in dieser Größenordnung (Kim et al., 2010). Biologische Methoden der Nanopartikelsynthese unter Verwendung von Mikroorganismen (Klaus et al., 1999; Konishi und Uruga, 2007), Enzymen (Willner et al., 2006), Pilzen (Vigneshwaran et al., 2007) sowie Pflanzen oder Pflanzenextrakten (Shankar et al., 2004; Ahmad et al., 2011) wurden als mögliche umweltfreundliche Alternativen zu chemischen und physikalischen Methoden vorgeschlagen. Die Entwicklung grüner Verfahren zur Synthese von Nanopartikeln entwickelt sich zu einem wichtigen Zweig der Nanotechnologie, insbesondere bei Silbernanopartikeln, die viele Anwendungen haben (Armendariz et al., 2002; Kim et al., 2010; Kyriacou et al., 2004). Chemische Syntheseverfahren führen dazu, dass sich auf der Oberfläche einige giftige Chemikalien anlagern, die bei medizinischen Anwendungen nachteilige Wirkungen haben können.

Die grüne Synthese stellt gegenüber chemischen und physikalischen Methoden einen Fortschritt dar, da sie kostengünstig und umweltfreundlich ist, sich leicht für die Synthese im großen Maßstab hochskalieren lässt und bei diesem Verfahren weder hoher Druck noch viel Energie, hohe Temperaturen oder giftige Chemikalien erforderlich sind (Singh et al., 2010; Jain et al., 2009).

In den letzten Jahren haben Silbernanopartikel (Ag-NPs) aufgrund ihrer außergewöhnlichen Eigenschaften, darunter antibakterielle Aktivität, hohe Oxidationsbeständigkeit und hohe Wärmeleitfähigkeit, erhebliche Aufmerksamkeit für medizinische und chemische Anwendungen erregt (Feng et al., 2006; Lee, 2007; Soni und Prakash, 2011). Neuere Befunde haben gezeigt, dass Nanosilber entzündungshemmende Wirkungen hat und die Wundheilung sowie die Wundversorgung verbessert. Sollten sich diese Ergebnisse in vivo bestätigen, könnte Nanosilber für die Behandlung von Geschwüren geeignet sein (Karla et al., 2010).

Ziel der vorliegenden Studie war es, die Synthese von Silbernanopartikeln mit Leishmania tropica zu bewerten und die Eigenschaften des erzeugten Materials zu bestimmen. Diese Studie ist der erste Nachweis der Biosynthese von Silbernanopartikeln durch L. tropica im Irak.

MATERIAL UND METHODEN

Probenentnahme

Für die Isolierung von Leishmania-Arten aus ihren Kulturen wurden vierundvierzig (44) Patienten ausgewählt. Hautabstriche wurden von der Läsion entnommen, Ausstriche auf einem Objektträger angefertigt, mit Giemsa gefärbt und mikroskopisch auf das Vorhandensein von Amastigoten untersucht. Die bakterielle Kontamination der Leishmania-Kulturen wurde minimiert, indem die Läsionen vor der Probenentnahme mit 70 % Methanol gereinigt und lokal debridiert wurden. Von jedem Patienten wurden mindestens zwei Giemsa-gefärbte Objektträger für die mikroskopische Untersuchung vorbereitet und kultiviert.

Kultur

Die Proben wurden vom Rand der Hautläsionen aspiriert und in der flüssigen Phase (physiologische Kochsalzlösung) von Novy-MacNeal-Nicolle-Medien (NNN) kultiviert. Die Kultur wurde bei 25 °C inkubiert und 28 Tage lang auf das Wachstum von Leishmania-Promastigoten überprüft. Der in der NNN-Medienkultur verwendeten phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) wurden Penicillin G und Streptomycin zugesetzt (Eisenberger und Jaffe, 1999; Farahmand et al., 2008).

PCR

Der PCR-Assay wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers (Sinagen, Iran) mit einem Endvolumen von 25 μL je PCR-Reaktion durchgeführt. Die PCR-Amplifikation erfolgte in einem DNA-Thermocycler (Master cycler gradient, San Leonardo, Kanada) unter folgenden Bedingungen: initiale Denaturierung (95 °C, 3 min; 63 °C, 30 s; 72 °C, 60 s) 1 Zyklus, gefolgt von 35 Zyklen mit Denaturierung (93 °C, 20 s), Annealing (63 °C, 20 s) und Extension (72 °C, 40 s). Schließlich wurden 10 μL der amplifizierten Proben ohne Zugabe von Ladepuffer in ein 2-%-Agarosegel mit 0,5 mg/ml Ethidiumbromid für die Elektrophorese geladen, und die Produkte wurden durch Ultraviolett-(UV-)Transillumination sichtbar gemacht.

Synthese der Ag-NPs

Die Zellkultur von L. tropica wurde 5 min lang bei 28 °C unter Rühren (5.000 U/min) (5 g) gehalten, bis sie von der Nährbrühe getrennt war; anschließend wurden die abgesetzten Zellen dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Ein Gramm (1 g) feuchte Zellmasse wurde dann separat in 0,001 M AgNO3-Lösung bei pH 5,4 bis 6,0 resuspendiert. Das gesamte Gemisch wurde 3 h lang bei Raumtemperatur (25 °C) belassen, und die Reaktion lief ab. Zur Charakterisierung wurden die Nanopartikelpulver in reinem Aceton verdünnt, und die hergestellte Suspension wurde mit Ultraschall behandelt. Die Biotransformation wurde routinemäßig durch visuelle Beobachtung der Biomasse sowie durch Messung der UV-Vis-Spektren der Leishmanien-Zellen überwacht. Die positive Reaktion zeigt sich in der Bildung einer gelbbraunen Färbung des Mediums aufgrund der Reduktion von Silberionen und der Bildung von Silbernanopartikeln im Medium. Für die Rasterelektronenmikroskopie wurden die verwendeten SEM-Träger vorbereitet, indem eine kleine Menge Probenpulver auf einen kupferbeschichteten Träger aufgebracht und unter einer Lampe getrocknet wurde. Die Silbernanopartikel erschienen kugelförmig, und die durchschnittliche Größe lag bei 35 bis 40 nm mit Abstand zwischen den Partikeln.

ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Diagnose von L. tropica mittels PCR, Kultur und Mikroskop

Bei 44 Patienten wurden Leishmania-Amastigoten durch mikroskopische Beobachtung untersucht; davon waren 38 (86,4 %) positiv; die NNN-Kultur führte jedoch in 40 Proben (90,1 %) zum Wachstum von Promastigoten. Außerdem zeigen die Ergebnisse, dass alle 10 Proben im PCR-Assay positiv waren (100 %).

UV-Vis-Spektroskopie und SEM

• Wurden L. tropica-Zellen Silberionen ausgesetzt, zeigten sie eine deutliche und recht breite UV-Vis-Absorptionsbande mit Zentrum bei 425 nm, da diese Nanopartikel gut dispergiert waren und nicht aggregierten. Das Auftreten dieser Bande, die einem Oberflächenplasmon zugeordnet wurde, ist für verschiedene Metallnanopartikel mit Größen von 2 bis 100 nm gut dokumentiert (El-Raheem et al., 2011). Die SEM zeigte die Bildung von Silbernanopartikeln mit einer durchschnittlichen Größe von 35 bis 40 nm mit Abstand zwischen den Partikeln. Die Form der Ag-NPs erwies sich als kugelförmig. Diese Ergebnisse bestätigen das Vorhandensein von primären und sekundären Aminbindungen sowie von C=O-, N=O-, C=N- und COOH-Bindungen von Proteinen als Deck- und Stabilisierungsmittel auf der Oberfläche der Nanopartikel (Fatemeh und Bahram, 2012; Ramezani et al., 2012).

Die Entwicklung eines zuverlässigen und umweltfreundlichen Verfahrens zur Synthese metallischer Nanopartikel ist ein wichtiger Schritt im Anwendungsbereich der Nanotechnologie. Chemische Syntheseverfahren führen dazu, dass sich auf der Oberfläche einige giftige Chemikalien anlagern, die bei medizinischen Anwendungen nachteilige Wirkungen haben können. Die Biosynthese stellt gegenüber chemischen und physikalischen Methoden einen Fortschritt dar, da sie kostengünstig und umweltfreundlich ist, sich leicht für die Synthese im großen Maßstab hochskalieren lässt und bei diesem Verfahren weder hoher Druck noch viel Energie, hohe Temperaturen oder giftige Chemikalien erforderlich sind. Daher besteht ein großer Bedarf an Silbernanopartikeln, die mit biologischen Methoden aus Pflanzenextrakten statt mit anderen giftigen Verfahren synthetisiert werden (Singh et al., 2010; Jain et al., 2009; Vyom et al., 2009). Die vorliegende Studie bestätigte, dass L. tropica in der Lage ist, innerhalb von 3 h Silbernanopartikel zu erzeugen, im Gegensatz zu anderen Forschern, die festgestellt hatten, dass das Hauptproblem bei biologischen Nanopartikeln die langsame Produktionsrate ist (Narayanan und Sakthivel, 2010). Dieser Ansatz zur Synthese von Silbernanopartikeln hat viele Vorteile wie die Skalierbarkeit des Verfahrens, wirtschaftliche Rentabilität und eine sichere Art der Nanopartikelherstellung. Parasitäre Erkrankungen (wie Malaria, Leishmaniose, Trypanosomiasis) sind weltweit große Gesundheitsprobleme (Edward und Krishna, 2004). Die antiparasitäre Chemotherapie ist die einzige Behandlungsmöglichkeit dieser parasitären Infektionen. Der Grund dafür ist, dass diese Infektionen keine ausgeprägte Immunantwort hervorrufen, sodass eine wirksame Impfung möglicherweise nicht möglich ist (Watkins, 2003).

Der Hauptgrund für die Verwendung von Ag-NPs in dieser Studie war ihre Fähigkeit, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zu erzeugen, für die Leishmania-Parasiten bekanntermaßen anfällig sind. Neuere Studien zeigten, dass ihre große Oberfläche, ihre geringe Größe und ihre Fähigkeit, schwefel- und phosphorhaltige Gruppen zu binden, zu einer Verstärkung ihrer antileishmanialen Wirkung führen können. Es wurde beobachtet, dass Ag-NPs die Stoffwechselaktivität und die Proliferationswerte der Parasiten im Vergleich zu den Kontrollgruppen verringerten (Allahverdiyev et al., 2011). Dieses anorganische Nanopartikel hat einen deutlichen Vorteil gegenüber herkömmlichen chemischen antimikrobiellen Wirkstoffen. Das wichtigste Problem, das chemische antimikrobielle Wirkstoffe verursachen, ist die Mehrfachresistenz. Daher wird dringend ein alternativer Weg benötigt, um die Arzneimittelresistenz verschiedener Mikroorganismen zu überwinden, insbesondere bei Medizinprodukten usw. Ag-Ionen werden seit Jahrzehnten als antimikrobielle Wirkstoffe in verschiedenen Bereichen eingesetzt, weil sie das Wachstum von Mikroorganismen hemmen (Kim et al., 2007). Unsere Ergebnisse stimmen mit anderen Ergebnissen aus verschiedenen Teilen der Welt überein (Allahverdiyev et al., 2011; Singh et al., 2010; Kim et al., 2007) und widersprechen anderen (Narayanan et al., 2010; Sondi und Salopek-Sondi, 2004). Die Nanopartikel wurden primär mittels UV-Vis-Spektroskopie charakterisiert, die sich als sehr nützliche Technik zur Analyse von Nanopartikeln erwiesen hat.

Die Reduktion der Silberionen und die Bildung stabiler Nanopartikel zeigten sich schnell, innerhalb von 3 h Reaktionszeit, was sie zu einer der schnellsten biologischen Reduktionsmethoden zur Herstellung von Silbernanopartikeln macht (Kim et al., 2007). Die mittels UV-Vis-Spektroskopie beobachtete Reduktion der in der wässrigen Lösung des Silberkomplexes vorhandenen Silberionen bei der Reaktion mit der Zellkultur von L. tropica ergab, dass das Vorhandensein von Silbernanopartikeln mit den UV-Vis-Spektren korreliert sein kann. Die UV-Vis-Spektroskopie ist bekanntermaßen geeignet, um Form und Größe von Nanopartikeln zu untersuchen. Die rasterelektronenmikroskopische Analyse bestätigte die Bioreduktion von Ag+-Ionen zu Silbernanopartikeln, und die morphologischen Abmessungen der Ag-NPs zeigten, dass sie zwischen 35 und 40 nm mit Abstand zwischen den Partikeln liegen und eine unregelmäßige Kugelform haben. Diese Ergebnisse stimmen mit denen anderer Forscher überein (Fatemeh und Bahram, 2012; Ramezani et al., 2012; Ponarulselvam et al., 2012). Die Studie kam zu dem Schluss, dass sich die Effizienz von L. tropica bei der Synthese von Silbernanopartikeln als höher erwies; zudem war diese Methode kostengünstig und ließ sich leicht für die Synthese im großen Maßstab hochskalieren.

Verfasst von Prof. Dr. Abdulsada A. Rahi und Dr. Magda A. Ali (Department of Biology, College of Science, Wasit University, Irak)