Grüne Synthese und Behandlung mit Silbernanopartikeln aus Leishmania major im Irak

Leishmaniosen sind eine Gruppe infektiöser, aber nicht ansteckender schwerer Parasitenerkrankungen, die durch Protozoen der Gattung Leishmania verursacht werden. Die Übertragung erfolgt durch die Blutmahlzeit infizierter weiblicher Sandmücken der Gattung Phlebotomus, die als Zwischenwirte dieser Parasiten gelten. Die begeißelte promastigote Form des Parasiten kommt in der Sandmücke vor; sobald sie von Makrophagen des Wirts aufgenommen wird, wandelt sie sich in die geißellose amastigote Form um (1,2).

Biologische Verfahren zur Synthese von Nanopartikeln (NPs) mithilfe von Mikroorganismen (3,4), Enzymen (5), Pilzen (6) sowie Pflanzen oder Pflanzenextrakten (7,8) wurden als mögliche umweltfreundliche Alternativen zu chemischen und physikalischen Verfahren vorgeschlagen. Die Entwicklung grüner Verfahren zur Synthese von Nanopartikeln entwickelt sich zu einem wichtigen Zweig der Nanotechnologie, insbesondere bei Silbernanopartikeln, die viele Anwendungen haben (9-11). Chemische Syntheseverfahren führen dazu, dass einige toxische Chemikalien an der Oberfläche adsorbiert sind, die bei medizinischen Anwendungen nachteilige Wirkungen haben können. Die grüne Synthese stellt gegenüber chemischen und physikalischen Verfahren einen Fortschritt dar, da sie kostengünstig und umweltfreundlich ist, sich leicht für die Synthese in großem Maßstab hochskalieren lässt und bei diesem Verfahren weder hoher Druck noch viel Energie, hohe Temperaturen oder toxische Chemikalien nötig sind (12,13). Silbernanopartikel spielen aufgrund ihrer attraktiven physikochemischen Eigenschaften eine tiefgreifende Rolle in Biologie und Medizin. Silberprodukte sind seit Langem für ihre starken hemmenden und bakteriziden Wirkungen sowie ein breites Spektrum antimikrobieller Aktivitäten bekannt, die seit Jahrhunderten zur Vorbeugung und Behandlung verschiedener Krankheiten, vor allem von Infektionen, genutzt werden (14).

Die Partikelgröße der NPs spielt eine wichtige Rolle für die antimikrobielle Wirksamkeit (15), sodass die stärkste Wirkung bei den NPs mit der geringsten Größe stärker ausgeprägt war als bei denen mit der größten Größe (16). Das Wachstum einiger Parasiten wie Giardia, Leishmania, Plasmodium, Toxoplasma und von Insektenlarven wird durch die Anwesenheit von Silbernanopartikeln, Gold, Chitosan und oxidierten Metallen gehemmt (17).

Materialien und Methoden: Herstellung von AgNPs-TA 5 ml Gerbsäure (Tannic Acid, TA) wurden bei 25 °C in einem Erlenmeyerkolben zu 5 ml AgNO 3 gegeben. Die Mischung wurde 5 Stunden lang unter starkem Magnetrühren gehalten, bis eine braune kolloidale Dispersion von AgNPs-TA zu sehen war, und bis zur Verwendung lichtgeschützt aufbewahrt.

Charakterisierung der Nanopartikel UV-Vis-Spektren wurden im Absorptionsmodus (Bereich 200-900 nm) mit einem Zweistrahlgerät aufgenommen, um die Bildung von Nanopartikeln zu überprüfen. Partikelgröße, Form und Morphologie wurden anhand von rasterelektronenmikroskopischen (SEM) Aufnahmen bewertet.

Herstellung der Promastigoten Amastigoten von L. major, die aus menschlichen Hautläsionen isoliert worden waren, wurden auf Novy‐MacNeal‐Nicolle-Medium (NNN) kultiviert, das Agar (4 mg/100 ml) und defibriniertes Kaninchenblut (10 %) enthielt. Nach der Umwandlung der Amastigoten in promastigotenähnliche Formen wurde das Wachstum der Promastigoten in RPMI-1640-Kulturmedium mit 100 μg/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin, ergänzt mit 10 % fetalem Kälberserum (FCS) (Gibco Co.), in einem Inkubator bei 28 °C zwei Wochen lang fortgesetzt. Während mehrerer Passagen wurde die Parasitensuspension in einer gekühlten Zentrifuge 10 Minuten lang bei 4500 U/min sedimentiert und der Überstand entfernt. So erreichten die Parasiten nach 12 Tagen eine feste Wachstumsphase (stationäre Phase) und waren bereit für die CL-Injektion und -Induktion (18, 19).

Versuchsgruppen Die mit L. major infizierten Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen zu je 10 Mäusen eingeteilt, wie folgt:

Gruppe 1 ohne Behandlung war die Kontrollgruppe. Gruppe 2 erhielt AgNPs in einer Dosis von 2 mg/kg unter Narkose (20). Gruppe 3 erhielt AgNPs-TA in einer Dosis von 2 mg/kg unter Narkose.

Alle oben genannten Behandlungen wurden an den Tagen null, 4, 8 und 12 in die Läsionen verabreicht.

Parameter zur Bewertung der Behandlungswirksamkeit Die Wirksamkeit der Behandlungen wurde anhand der Veränderungen der Läsion und der Parasitenlast der Milz erfasst. Die Größe der Läsionen wurde zweimal pro Woche gemessen. Die Mäuse wurden nach der ersten Behandlung getötet und ihre Milz entnommen, um die Zahl der lebensfähigen Parasiten zu bestimmen (21). Die Milzen der Tiere wurden in 6-Well-Platten mit komplettem RPMI‐1640-Medium gegeben. Nach der Homogenisierung des Milzgewebes wurde der Inhalt aller Wells mit komplettem RPMI‐1640-Medium auf 200 Mikroliter aufgefüllt. Alle Proben wurden in dreifacher Ausführung angesetzt. Die vorbereiteten Platten wurden 10 Tage lang bei 28 °C in den Inkubator gestellt. Schließlich wurden positive und negative Ergebnisse in Verdünnungsreihen auf der Grundlage mikroskopischer Beobachtungen angegeben.

Ergebnisse und Diskussion: Die Entwicklung eines zuverlässigen und umweltfreundlichen Verfahrens zur Synthese metallischer Nanopartikel ist ein wichtiger Schritt im Anwendungsbereich der Nanotechnologie. Bei chemischen Syntheseverfahren werden einige toxische Chemikalien an der Oberfläche adsorbiert, die bei medizinischen Anwendungen Nebenwirkungen haben können. Die grüne Synthese wird gegenüber dem chemischen und dem physikalischen Verfahren bevorzugt, da sie kostengünstig und umweltfreundlich ist, sich leicht für die Synthese in großem Maßstab hochskalieren lässt und bei diesem Verfahren weder hoher Druck noch viel Energie, hohe Temperaturen oder toxische Chemikalien nötig sind. Daher war die Herstellung von Silbernanopartikeln mit biologischen Verfahren auf Basis von Pflanzenextrakten anstelle anderer toxischer Verfahren die beste und wirksamste (22,23). Die Absorptionsbanden einiger metallischer Nanopartikel im sichtbaren Bereich zeigten sich aufgrund der kollektiven Schwingung von Elektronen in Resonanz mit der einfallenden elektromagnetischen Strahlung, der sogenannten Oberflächenplasmonenresonanz-Bande (SPR) (24). Sechzig Hautproben von Patienten mit Verdacht auf kutane Leishmaniose wurden mikroskopisch auf Leishmania-Amastigoten untersucht; davon waren 45 (75 %) positiv; die NNN-Kultur führte jedoch bei 42 Proben (70 %) zum Wachstum von Promastigoten. Außerdem zeigten die Ergebnisse, dass 54 (90 %) der Proben mit der PCR-Methode positiv waren; 60 % L. major und 30 % L. tropica.

Leishmania-major-Zellen zeigten bei Exposition gegenüber Silberionen eine ausgeprägte und recht breite UV-Vis-Absorptionsbande mit Zentrum bei 425 nm, da dieses Nanopartikel gut dispergiert und ohne Aggregation vorlag. Das Auftreten dieser Bande, die einem Oberflächenplasmon zugeordnet wurde, ist für verschiedene Metallnanopartikel mit Größen von 2 bis 100 nm gut dokumentiert (25). Die SEM zeigte die Bildung von Silbernanopartikeln mit einer durchschnittlichen Größe von 35 bis 40 nm mit Abstand zwischen den Partikeln. UV-Vis-Absorptionsspektren haben sich als recht empfindlich für die Bildung von Silberkolloiden erwiesen, da Silbernanopartikel aufgrund der Oberflächenplasmonenanregung eine intensive Absorptionsspitze aufweisen (26,27).

Das Erscheinungsbild der Parasiten in Gegenwart von AgNPs-TA legt einige mögliche Wirkmechanismen nahe. Frühere Literatur berichtet, dass Silber die Zellmembranoberfläche von Bakterien angreift und dabei Permeabilität, osmotisches Gleichgewicht und damit die Stoffwechselwege der Zelle verändert. Silbernanopartikel können sich auch an die DNA binden und die Replikation verhindern (28-32). Die SPR-Banden von mit TA beschichteten Gold- und Silbernanopartikeln waren im Vergleich zu den in der Literatur berichteten Werten von 520 bzw. 380-450 nm rotverschoben (33,34). Dieser bathochrome Effekt wird wahrscheinlich durch die supramolekulare Wechselwirkung zwischen den Nanopartikeln und dem oberflächenschützenden Polyphenol TA verursacht, die die Energie des Elektronentransfers verändert. Neben Form, Größe und Art des Materials hängt die Lage der SPR-Bande stark von der Dielektrizitätskonstante des umgebenden Mediums ab, da diese die Resonanzfrequenz der Elektronen auf der Oberfläche der NMNPs verändert (35-37).

Schlussfolgerungen: Mit Gerbsäure synthetisierte Silbernanopartikel haben ein Anwendungspotenzial als antileishmaniale Behandlung. Darüber hinaus trägt die Verwendung natürlicher Verbindungen zur Entwicklung sauberer, nichttoxischer, biokompatibler und umweltverträglicher Verfahren zur Synthese von Edelmetallnanopartikeln bei.

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Abdulsada A. Rahi 1*, Magda A. Ali 2 and Zaid A. Abdulabbas ( Department of Biology, College of Science, Wasit University, Kut, Iraq.)  (College of Medicine, Wasit University, Kut, Iraq)