SmartPE verbessert Prime Editing bei zweikeimblättrigen Nutzpflanzen
Forschende der Chinesischen Akademie der Wissenschaften konstruieren Guide-RNAs neu und erreichen bei Tomaten und Sojabohnen Editing-Effizienzen von bis zu 20 Prozent.
Von Letizia Giugliano
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Molekularbiologen ist es schwergefallen, Prime Editing auf breitblättrige Pflanzen zu übertragen, weil die Editing-Raten bei zweikeimblättrigen Arten regelmäßig hinter denen von Gräsern zurückbleiben. Um diese Hürde zu überwinden, entwickelten Forschende der Chinesischen Akademie der Wissenschaften ein konstruiertes Prime-Editing-System namens SmartPE. Die biologische Erfindung, veröffentlicht in Nature Plants, erhöht die Modifikationsraten an Zielstellen in Geweben von Tomate, Sojabohne und Raps.
Konstruierte Templates lösen den Effizienzengpass bei Zweikeimblättrigen
Prime Editing ermöglicht es Forschenden, Basensubstitutionen sowie kleine Insertionen und Deletionen einzufügen, ohne Doppelstrangbrüche der DNA zu erzeugen oder Donor-Templates zu benötigen. Die Erfindung minimiert unbeabsichtigte Insertionen und Nebenprodukte, doch ihre Leistung bei zweikeimblättrigen Nutzpflanzen blieb hartnäckig niedrig und schwankte je nach genomischem Ort stark.
Um die Expressionsniveaus der Editing-Maschinerie zu erhöhen, testete ein Team unter Leitung von Professorin Gao Caixia am Institut für Genetik und Entwicklungsbiologie der Chinesischen Akademie der Wissenschaften zunächst regulatorische Sequenzen, die zwischen Promotor und Cas9-Sequenz eingefügt wurden. Laut Phys.org erhöhte das Einfügen einer als START-Element bekannten cis-regulatorischen Sequenz die Transkriptmengen um das 2,1-Fache und steigerte die Editing-Raten an vier Teststellen in Arabidopsis um etwa das 1,8-Fache.
Als Nächstes wurde ein Design mit paarigen Prime-Editing-Guide-RNAs getestet, doch paarige Guide-RNAs allein steigerten die Effizienz nicht. Die Forschenden vermuteten, dass die enge komplementäre Paarung zwischen dem Reverse-Transkriptase-Template und der genomischen DNA das Fortschreiten des Enzyms behinderte, während zelluläre Mismatch-Reparaturwege die Edits unterdrückten. Das Team reagierte, indem es gezielt Basenfehlpaarungen in die Reverse-Transkriptase-Templates beider Guide-RNAs einführte – eine technische Innovation, die die durchschnittliche Editing-Aktivität an vier Zielstellen um mehr als das Sechsfache auf etwa 10 % steigerte.
Die Template-Architektur bestimmt die Reverse Transkription
Das Forschungsteam kartierte systematisch, wie Abstand und Position der eingeführten Fehlpaarungen die Editing-Ergebnisse veränderten. Tests ergaben, dass durchgehende Fehlpaarungen oder solche im Abstand von 3 bp die höchste Leistung erbrachten und Effizienzen von bis zu 20 % erreichten, wie Phys.org berichtet. Wuchs der Abstand zwischen den Fehlpaarungen auf 6 Basenpaare oder mehr, fielen die Editing-Raten stark ab.
Auch die Position entschied über das Ergebnis. Fehlgepaarte Basen an beiden Rändern des Editing-Fensters verbesserten die Initiierung der Reverse Transkription, während sie in der Mitte platziert keinen Nutzen brachten. Tests in menschlichen Zelllinien zeigten, dass die Hemmung des Mismatch-Reparaturwegs die Ergebnisse von SmartPE nicht in derselben Weise veränderte wie das Standard-Editing mit einer einzelnen Guide-RNA, was darauf hindeutet, dass das System mit zwei Guide-RNAs auf alternative zelluläre Reparaturwege angewiesen ist.
Gezielte Veränderungen von Nutzpflanzen und Grenzen bei Insertionen
Die Forschenden validierten das Werkzeug in Nutzpflanzen-Protoplasten. Sechs von neun Zielstellen in Tomate überschritten eine Editing-Effizienz von 10 %, neun von elf Zielstellen in Sojabohne übertrafen 5 %, und fünf Zielstellen in Raps erreichten oder übertrafen 10 % – Loci, an denen herkömmliche Prime-Editoren nahezu inaktiv waren. Durch den Einbau synonymischer Codonänderungen, um die erforderlichen Template-Fehlpaarungen zu erzeugen, führte das Team einzelne Aminosäureänderungen an Zielstellen in Sojabohne und Tomate mit Effizienzen ein, die 1,6- bis 11,1-mal höher lagen als bei Standardmethoden.
In Experimenten zur stabilen Transformation an behaarten Wurzeln von Tomaten am Locus SlOR2 erzeugte SmartPE 7,3 % homozygote und 12,5 % heterozygote Edits, während herkömmliches Prime Editing nur Chimären und 1,0 % heterozygote Edits lieferte. In Arabidopsis und Tomate fügte die Methode erfolgreich Protein-Tags, Enhancer und Rekombinationsstellen mit Raten von bis zu 32 % ein. In Sojabohnen ergaben stabile Transformationen jedoch nur Chimären, was darauf hindeutet, dass weitere Technologietransfers, die Entwicklung geistigen Eigentums und die Verfeinerung der Protokolle nötig bleiben, bevor das Werkzeug bei allen Hülsenfrüchten zuverlässig stabile Edits liefern kann.
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