Biosíntesis de nanopartículas de plata por Leishmania tropica

La leishmaniasis es una enfermedad parasitaria provocada por 20 especies distintas de Leishmania. Se ha notificado leishmaniasis en 88 países y se estima que 350 millones de personas en todo el mundo corren el riesgo de contraer alguna de las formas de la enfermedad, y que 12 millones están infectadas, con una tasa de incidencia anual de aproximadamente 1,5 a 2 millones. Según las estimaciones de la OMS, el 90 % de los casos cutáneos se producen en seis países. La leishmaniasis, según el agente causante y el trasfondo genético del huésped, presenta diversas manifestaciones, que van desde una lesión que se cura sola hasta una forma sistémica letal de la enfermedad. Las dos formas clínicas más comunes de la enfermedad, la leishmaniasis cutánea (LC) y la leishmaniasis visceral (LV), se observan principalmente en 14 de los 22 países de la Región del Mediterráneo Oriental (EMRO) (Postigo, 2010). Tradicionalmente, los parásitos Leishmania se detectan directamente mediante el examen microscópico de muestras clínicas. Sin embargo, en una zona endémica, la LC generalmente puede diagnosticarse solo por su aspecto clínico (Kaur et al., 2003). La nanotecnología es el estudio del control de la materia a escala atómica y molecular. En general, se ocupa de estructuras de un tamaño de 100 nm o menos en al menos una dimensión, e implica el desarrollo de materiales o dispositivos dentro de ese tamaño (Kim et al., 2010). Los métodos biológicos de síntesis de nanopartículas que emplean microorganismos (Klaus et al., 1999; Konishi y Uruga, 2007), enzimas (Willner et al., 2006), hongos (Vigneshwaran et al., 2007) y plantas o extractos vegetales (Shankar et al., 2004; Ahmad et al., 2011) se han propuesto como posibles alternativas ecológicas a los métodos químicos y físicos. El desarrollo de procesos verdes para la síntesis de nanopartículas se está convirtiendo en una importante rama de la nanotecnología, especialmente en el caso de las nanopartículas de plata, que tienen muchas aplicaciones (Armendariz et al., 2002; Kim et al., 2010; Kyriacou et al., 2004). Los métodos de síntesis química conllevan la presencia de algunos productos químicos tóxicos adsorbidos en la superficie que pueden tener efectos adversos en las aplicaciones médicas.

La síntesis verde supone un avance respecto a los métodos químicos y físicos, ya que es rentable, respetuosa con el medio ambiente y fácilmente escalable para la síntesis a gran escala, y en este método no hace falta utilizar alta presión, energía, temperatura ni productos químicos tóxicos (Singh et al., 2010; Jain et al., 2009).

En los últimos años, las nanopartículas de plata (Ag-NP) han atraído una atención considerable para aplicaciones médicas y químicas debido a sus propiedades excepcionales, entre ellas la actividad antibacteriana, la alta resistencia a la oxidación y la elevada conductividad térmica (Feng et al., 2006; Lee, 2007; Soni y Prakash, 2011). Recientemente, algunos hallazgos han demostrado que la nanoplata tiene efectos antiinflamatorios y favorece la cicatrización y los apósitos de heridas. Si estos resultados se confirman in vivo, la nanoplata podría ser adecuada para el tratamiento de úlceras (Karla et al., 2010).

El objetivo del presente estudio fue evaluar la síntesis de nanopartículas de plata utilizando Leishmania tropica y determinar las características del material producido. Este estudio es el primer registro de biosíntesis de nanopartículas de plata por L. tropica en Irak.

MATERIALES Y MÉTODOS

Recogida de muestras

Se seleccionaron cuarenta y cuatro (44) pacientes para aislar especies de Leishmania a partir de sus cultivos. Se obtuvieron raspados de piel de la lesión y se prepararon frotis en un portaobjetos, teñidos con Giemsa y examinados al microscopio para detectar la presencia de amastigotes. La contaminación bacteriana de los cultivos de Leishmania se minimizó limpiando las lesiones con metanol al 70 % y realizando un desbridamiento local antes de obtener las muestras. De cada paciente se prepararon al menos dos portaobjetos teñidos con Giemsa para el examen microscópico y el cultivo.

Cultivo

Las muestras se aspiraron del borde de las lesiones cutáneas y se cultivaron en fase líquida (solución salina normal) de medio Novy MacNeal Nicolle (NNN). El cultivo se incubó a 25 °C y se comprobó el crecimiento de promastigotes de Leishmania durante 28 días. Se añadieron penicilina-G y estreptomicina a la solución salina tamponada con fosfato (PBS) utilizada en el cultivo en medio NNN (Eisenberger y Jaffe, 1999; Farahmand et al., 2008).

PCR

El ensayo de PCR se realizó según el protocolo del fabricante (Sinagen, Irán) con un volumen final de 25 μL por cada reacción de PCR. La amplificación por PCR se llevó a cabo en un termociclador de ADN (Master cycler gradient, San Leonardo, Canadá) en las siguientes condiciones: desnaturalización inicial (95 °C, 3 min; 63 °C, 30 s; 72 °C, 60 s) 1 ciclo, seguido de 35 ciclos que incluían desnaturalización (93 °C, 20 s), hibridación (63 °C, 20 s) y extensión (72 °C, 40 s). Por último, se cargaron 10 μL de las muestras amplificadas, sin añadir tampón de carga, en un gel de agarosa al 2 % que contenía 0,5 mg/ml de bromuro de etidio para la electroforesis, y los productos se visualizaron mediante transiluminación ultravioleta (UV).

Síntesis de Ag-NP

El cultivo celular de L. tropica se mantuvo en agitación (5.000 rpm) (5 g) durante 5 min a 28 °C hasta que se separó del caldo de cultivo; después, las células sedimentadas se lavaron con agua destilada tres veces. Un gramo (1 g) de masa celular húmeda se resuspendió entonces por separado en una solución de AgNO3 0,001 M a pH 5,4 a 6,0. La mezcla total se dejó a temperatura ambiente (25 °C) durante 3 h y se llevó a cabo la reacción. Para la caracterización, los polvos de nanopartículas se diluyeron en acetona pura y la suspensión preparada se sometió a ultrasonidos. La biotransformación se controló de forma rutinaria mediante observación visual de la biomasa y medición de los espectros UV–Vis de las células de leishmania. La reacción positiva se manifiesta con la formación de un color amarillo-marrón del medio debido a la reducción de los iones de plata y a la producción de nanopartículas de plata en el medio. Para la microscopía electrónica de barrido utilizada, las rejillas SEM se prepararon colocando una pequeña cantidad de polvo de muestra sobre una rejilla recubierta de cobre y secándola bajo una lámpara. Las nanopartículas de plata aparecieron con forma esférica y el tamaño medio fue de 35 a 40 nm con distancia entre partículas.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Diagnóstico de L. tropica mediante PCR, cultivo y microscopio

En 44 pacientes se buscaron amastigotes de Leishmania mediante observación microscópica, de los cuales 38 (86,4 %) resultaron positivos; sin embargo, el cultivo en medio NNN dio lugar al crecimiento de promastigotes en 40 muestras (90,1 %). Además, los resultados muestran que las 10 muestras fueron positivas (100 %) en el ensayo de PCR.

Espectroscopía UV–vis y SEM

• Las células de L. tropica expuestas a iones de plata mostraron una banda de absorción UV–Vis nítida y bastante ancha, centrada en 425 nm, porque esta nanopartícula estaba bien dispersa sin agregación. La aparición de esta banda, atribuida a un plasmón superficial, está bien documentada para diversas nanopartículas metálicas con tamaños de entre 2 y 100 nm (El-Raheem et al., 2011). La SEM mostró la formación de nanopartículas de plata con un tamaño medio de 35 a 40 nm con distancia entre partículas. Las formas de las Ag-NP resultaron ser esféricas. Estos resultados confirman la presencia de enlaces de aminas primarias y secundarias; enlaces C=O, N=O, C=N y COOH de proteínas como agente de recubrimiento y estabilización en la superficie de las nanopartículas (Fatemeh y Bahram, 2012; Ramezani et al., 2012).

El desarrollo de un proceso fiable y ecológico para la síntesis de nanopartículas metálicas es un paso importante en el campo de la aplicación de la nanotecnología. Los métodos de síntesis química conllevan la presencia de algunos productos químicos tóxicos adsorbidos en la superficie que pueden tener efectos adversos en las aplicaciones médicas. La biosíntesis supone un avance respecto a los métodos químicos y físicos, ya que es rentable, respetuosa con el medio ambiente y fácilmente escalable para la síntesis a gran escala, y en este método no hace falta utilizar alta presión, energía, temperatura ni productos químicos tóxicos. Por ello, existe una gran necesidad de nanopartículas de plata sintetizadas mediante métodos biológicos con extracto vegetal en lugar de otros métodos tóxicos (Singh et al., 2010; Jain et al., 2009; Vyom et al., 2009). El presente estudio confirmó que L. tropica es capaz de producir nanopartículas de plata en 3 h, a diferencia de otros investigadores que hallaron que el principal problema de las nanopartículas biológicas es la lentitud de la producción (Narayanan y Sakthivel, 2010). Este enfoque de la síntesis de nanopartículas de plata presenta muchas ventajas, como la escalabilidad del proceso, la viabilidad económica y una forma segura de producir nanopartículas. Las enfermedades parasitarias (como el paludismo, la leishmaniasis o la tripanosomiasis) son importantes problemas de salud en todo el planeta (Edward y Krishna, 2004). La quimioterapia antiparasitaria es la única opción de tratamiento de estas infecciones parasitarias. La razón es que estas infecciones no provocan una respuesta inmunitaria pronunciada, por lo que una vacunación eficaz podría no ser posible (Watkins, 2003).

La razón principal para utilizar Ag-NP en este estudio fue su capacidad de producir especies reactivas de oxígeno (ROS), a las que se sabe que los parásitos Leishmania son sensibles. Estudios recientes mostraron que sus amplias superficies, sus pequeños tamaños y su capacidad de unirse a grupos que contienen azufre y fósforo pueden dar lugar a un aumento de sus efectos antileishmaniásicos. Se observó que las Ag-NP disminuían la actividad metabólica y los valores de proliferación de los parásitos en comparación con los grupos de control (Allahverdiyev et al., 2011). Esta nanopartícula inorgánica tiene una clara ventaja sobre los agentes antimicrobianos químicos convencionales. El problema más importante que causan los agentes antimicrobianos químicos es la resistencia a múltiples fármacos. Por ello, se necesita desesperadamente una vía alternativa para superar la resistencia a los fármacos de diversos microorganismos, especialmente en productos sanitarios, etc. Los iones de Ag se han utilizado durante décadas como agente antimicrobiano en diversos campos por su capacidad de inhibir el crecimiento de microorganismos (Kim et al., 2007). Nuestros resultados concuerdan con otros resultados de distintas partes del mundo (Allahverdiyev et al., 2011; Singh et al., 2010; Kim et al., 2007) y discrepan de otros (Narayanan et al., 2010; Sondi y Salopek-Sondi, 2004). Las nanopartículas se caracterizaron principalmente mediante espectroscopía UV-vis, que demostró ser una técnica muy útil para el análisis de nanopartículas.

La reducción de los iones de plata y la formación de nanopartículas estables aparecieron rápidamente, en 3 h de reacción, lo que lo convierte en uno de los métodos de biorreducción más rápidos para producir nanopartículas de plata (Kim et al., 2007). La reducción de los iones de plata presentes en la solución acuosa del complejo de plata durante la reacción con el cultivo celular de L. tropica, observada mediante espectroscopía UV-Vis, reveló la presencia de nanopartículas de plata, que puede correlacionarse con los espectros UV-Vis. Es bien sabido que la espectroscopía UV-Vis sirve para investigar la forma y el tamaño de las nanopartículas. El análisis por microscopía electrónica de barrido confirmó la biorreducción de los iones Ag+ a nanopartículas de plata, y las dimensiones morfológicas de las Ag-NP demostraron que estaban entre 35 y 40 nm con distancia entre partículas y que tienen una forma esférica irregular. Estos hallazgos concuerdan con los de otros investigadores (Fatemeh y Bahram, 2012; Ramezani et al., 2012; Ponarulselvam et al., 2012). Este estudio concluyó que la eficiencia de L. tropica para la síntesis de nanopartículas de plata resultó ser mayor; además, este método era rentable y fácilmente escalable para la síntesis a gran escala.

Escrito por el prof. Dr. Abdulsada A. Rahi y la Dra. Magda A. Ali (Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de Wasit, Irak)