SmartPE impulsa la edición de precisión en cultivos dicotiledóneos
Investigadores de la Academia China de Ciencias rediseñan los ARN guía para alcanzar una eficiencia de edición de hasta el 20 % en tomates y sojas.
Por Letizia Giugliano
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Los biólogos moleculares han tenido dificultades para adaptar la edición de precisión a las plantas de hoja ancha, porque las tasas de edición en las especies dicotiledóneas suelen quedarse por detrás de las de las gramíneas. Para superar esa barrera, investigadores de la Academia China de Ciencias desarrollaron un sistema de edición de precisión modificado llamado SmartPE. La invención biológica, publicada en Nature Plants, eleva las tasas de modificación dirigida en tejidos de tomate, soja y colza.
Plantillas modificadas para superar el cuello de botella de la eficiencia en dicotiledóneas
La edición de precisión permite a los investigadores introducir sustituciones de bases, pequeñas inserciones y deleciones sin crear roturas de doble cadena en el ADN ni requerir plantillas donantes. La invención minimiza las inserciones y los subproductos no deseados, pero su rendimiento en cultivos dicotiledóneos ha seguido siendo obstinadamente bajo e irregular entre distintos loci genómicos.
Para elevar los niveles de expresión de la maquinaria de edición, un equipo dirigido por la profesora Gao Caixia, del Instituto de Genética y Biología del Desarrollo de la Academia China de Ciencias, probó primero secuencias reguladoras colocadas entre el promotor y la secuencia de Cas9. Según Phys.org, la inserción de una secuencia cis-reguladora conocida como elemento START aumentó los niveles de transcrito 2,1 veces y elevó las tasas de edición en cuatro sitios de prueba de Arabidopsis en aproximadamente 1,8 veces.
A continuación se probó un diseño de ARN guía de edición de precisión emparejado, pero los ARN guía emparejados por sí solos no lograron aumentar la eficiencia. Los investigadores razonaron que el estrecho emparejamiento complementario entre la plantilla de la transcriptasa inversa y el ADN genómico estaba frenando el avance de la enzima, mientras que las vías celulares de reparación de desemparejamientos estaban suprimiendo las ediciones. El equipo respondió introduciendo desemparejamientos de bases intencionados en las plantillas de transcriptasa inversa de ambos ARN guía, una innovación técnica que elevó la actividad de edición media en cuatro sitios diana más de seis veces, hasta alrededor del 10 %.
La arquitectura de la plantilla determina la transcripción inversa
El equipo de investigación cartografió sistemáticamente cómo la separación y la posición de los desemparejamientos introducidos alteraban los resultados de la edición. Las pruebas revelaron que los desemparejamientos continuos o los colocados a 3 pb de distancia ofrecían el mejor rendimiento, alcanzando eficiencias de hasta el 20 %, según informó Phys.org. Cuando la distancia entre desemparejamientos se ampliaba a 6 pares de bases o más, las tasas de edición se desplomaban.
La posición también determinaba el resultado. Colocar las bases desemparejadas en ambos bordes de la ventana de edición mejoraba el inicio de la transcripción inversa, mientras que colocarlas directamente en el centro no aportaba ningún beneficio. Las pruebas en líneas celulares humanas revelaron que inhibir la vía de reparación de desemparejamientos no alteraba los resultados de SmartPE del mismo modo en que cambiaba la edición estándar con un solo guía, lo que indica que el sistema de doble guía se apoya en vías celulares de reparación alternativas.
Modificaciones dirigidas en cultivos y límites de inserción
Los investigadores validaron la herramienta en protoplastos de cultivos. Seis de cada nueve dianas de tomate superaron el 10 % de eficiencia de edición, nueve de cada once dianas de soja superaron el 5 %, y cinco dianas de colza alcanzaron o superaron el 10 %, loci en los que los editores de precisión convencionales eran casi inactivos. Al incorporar cambios de codones sinónimos para producir los desemparejamientos de plantilla necesarios, el equipo introdujo cambios de un solo aminoácido en dianas de soja y tomate con eficiencias de 1,6 a 11,1 veces superiores a las de los métodos estándar.
En experimentos de transformación estable en raíces pilosas de tomate en el locus SlOR2, SmartPE produjo un 7,3 % de ediciones homocigotas y un 12,5 % de heterocigotas, mientras que la edición de precisión convencional solo generó quimeras y un 1,0 % de ediciones heterocigotas. En Arabidopsis y tomate, el método insertó con éxito etiquetas proteicas, potenciadores y sitios de recombinación con tasas de hasta el 32 %. En soja, sin embargo, las transformaciones estables solo produjeron quimeras, lo que indica que aún son necesarias más transferencia tecnológica, desarrollo de propiedad intelectual y perfeccionamiento de protocolos antes de que la herramienta pueda ofrecer de forma fiable ediciones estables en todas las leguminosas.
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