Biosynthèse de nanoparticules d’argent par Leishmania tropica

La leishmaniose est une maladie parasitaire provoquée par 20 espèces différentes de Leishmania. La leishmaniose est signalée dans 88 pays ; on estime que 350 millions de personnes dans le monde risquent de contracter l’une de ses formes et que 12 millions sont infectées, avec une incidence annuelle d’environ 1,5 à 2 millions de cas. Selon les estimations de l’OMS, 90 % des cas cutanés surviennent dans six pays. Selon l’agent causal et le terrain génétique de l’hôte, la leishmaniose se présente sous diverses manifestations, allant d’une lésion qui guérit spontanément à une forme systémique mortelle. Les deux formes cliniques les plus courantes de la maladie, la leishmaniose cutanée (LC) et la leishmaniose viscérale (LV), s’observent principalement dans 14 des 22 pays de la région de la Méditerranée orientale (EMRO) (Postigo, 2010). Traditionnellement, les parasites Leishmania sont détectés directement par examen microscopique d’échantillons cliniques. Cependant, dans une zone endémique, la LC peut généralement être diagnostiquée sur son seul aspect clinique (Kaur et al., 2003). La nanotechnologie est l’étude du contrôle de la matière à l’échelle atomique et moléculaire. En général, elle concerne des structures dont la taille est de 100 nm ou moins dans au moins une dimension, et implique le développement de matériaux ou de dispositifs dans cette gamme de taille (Kim et al., 2010). Les méthodes biologiques de synthèse de nanoparticules à l’aide de micro-organismes (Klaus et al., 1999 ; Konishi et Uruga, 2007), d’enzymes (Willner et al., 2006), de champignons (Vigneshwaran et al., 2007), ou de plantes et d’extraits de plantes (Shankar et al., 2004 ; Ahmad et al., 2011) ont été suggérées comme alternatives écologiques possibles aux méthodes chimiques et physiques. Le développement de procédés verts pour la synthèse de nanoparticules devient une branche importante des nanotechnologies, en particulier pour les nanoparticules d’argent, qui ont de nombreuses applications (Armendariz et al., 2002 ; Kim et al., 2010 ; Kyriacou et al., 2004). Les méthodes de synthèse chimique entraînent la présence de produits chimiques toxiques adsorbés en surface, ce qui peut avoir un effet néfaste dans les applications médicales.

La synthèse verte constitue un progrès par rapport aux méthodes chimiques et physiques, car elle est économique, respectueuse de l’environnement, facilement transposable à grande échelle pour une synthèse à grande échelle, et cette méthode ne nécessite ni haute pression, ni énergie, ni température élevée, ni produits chimiques toxiques (Singh et al., 2010 ; Jain et al., 2009).

Ces dernières années, les nanoparticules d’argent (Ag-NPs) ont suscité un intérêt considérable pour les applications médicales et chimiques en raison de leurs propriétés exceptionnelles, notamment leur activité antibactérienne, leur forte résistance à l’oxydation et leur conductivité thermique élevée (Feng et al., 2006 ; Lee, 2007 ; Soni et Prakash, 2011). Récemment, des résultats ont démontré que le nano-argent a des effets anti-inflammatoires et favorise la cicatrisation et le pansement des plaies. Si ces résultats sont confirmés in vivo, le nano-argent pourrait convenir au traitement des ulcères (Karla et al., 2010).

L’objectif de la présente étude était d’évaluer la synthèse de nanoparticules d’argent à l’aide de Leishmania tropica et de déterminer les caractéristiques du matériau produit. Cette étude est le premier enregistrement de biosynthèse de nanoparticules d’argent par L. tropica en Irak.

MATÉRIELS ET MÉTHODES

Collecte des échantillons

Quarante-quatre (44) patients ont été sélectionnés pour l’isolement d’espèces de Leishmania à partir de leurs cultures. Des raclages cutanés de la lésion ont été obtenus et des frottis préparés sur lame, colorés au Giemsa et examinés au microscope pour y rechercher des amastigotes. La contamination bactérienne des cultures de Leishmania a été réduite au minimum en nettoyant les lésions avec du méthanol à 70 % et par un débridement local avant le prélèvement des échantillons. Au moins deux lames colorées au Giemsa ont été préparées pour chaque patient pour l’examen microscopique et la mise en culture.

Culture

Les échantillons ont été aspirés au bord des lésions cutanées et mis en culture en phase liquide (sérum physiologique) du milieu Novy MacNeal Nicolle (NNN). La culture a été incubée à 25 °C et surveillée pendant 28 jours pour détecter la croissance de promastigotes de Leishmania. De la pénicilline G et de la streptomycine ont été ajoutées à la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) utilisée dans la culture sur milieu NNN (Eisenberger et Jaffe, 1999 ; Farahmand et al., 2008).

PCR

Le test PCR a été réalisé selon le protocole du fabricant (Sinagen, Iran), avec un volume final de 25 μL pour chaque réaction PCR. L’amplification PCR a été effectuée dans un thermocycleur d’ADN (Master cycler gradient, San Leonardo, Canada) dans les conditions suivantes : dénaturation initiale (95 °C, 3 min ; 63 °C, 30 s ; 72 °C, 60 s) pendant 1 cycle, suivie de 35 cycles comprenant une dénaturation (93 °C, 20 s), une hybridation (63 °C, 20 s) et une élongation (72 °C, 40 s). Enfin, 10 μL d’échantillons amplifiés, sans ajout de tampon de charge, ont été déposés sur un gel d’agarose à 2 % contenant 0,5 mg/ml de bromure d’éthidium pour l’électrophorèse, et les produits ont été visualisés par transillumination aux ultraviolets (UV).

Synthèse des Ag-NPs

La culture cellulaire de L. tropica a été maintenue sous agitation (5 000 tr/min) (5 g) pendant 5 min à 28 °C jusqu’à ce qu’elle soit séparée du bouillon de culture, puis les cellules sédimentées ont été lavées trois fois à l’eau distillée. Un gramme (1 g) de masse cellulaire humide a ensuite été remis en suspension séparément dans une solution d’AgNO3 à 0,001 M, à un pH de 5,4 à 6,0. L’ensemble du mélange a été laissé à température ambiante (25 °C) pendant 3 h, et la réaction a eu lieu. Pour la caractérisation, les poudres de nanoparticules ont été diluées dans de l’acétone pur et la suspension préparée a été traitée aux ultrasons. La biotransformation a été suivie en routine par observation visuelle de la biomasse ainsi que par mesure des spectres UV-Vis des cellules de leishmanies. La réaction positive se manifeste par la formation d’une coloration jaune-brun du milieu, due à la réduction des ions argent et à la production de nanoparticules d’argent dans le milieu. Pour la microscopie électronique à balayage, les grilles SEM utilisées ont été préparées en déposant une petite quantité de poudre d’échantillon sur une grille recouverte de cuivre, séchée sous lampe. Les nanoparticules d’argent sont apparues de forme sphérique, avec une taille moyenne de 35 à 40 nm et une distance interparticulaire.

RÉSULTATS ET DISCUSSION

Diagnostic de L. tropica par PCR, culture et microscope

La présence d’amastigotes de Leishmania a été recherchée par observation microscopique chez 44 patients, dont 38 (86,4 %) étaient positifs ; cependant, la culture NNN a permis la croissance de promastigotes dans 40 échantillons (90,1 %). Par ailleurs, les résultats montrent que les 10 échantillons étaient tous positifs (100 %) au test PCR.

Spectroscopie UV-vis et SEM

• Les cellules de L. tropica exposées aux ions argent ont présenté une bande d’absorption UV-Vis distincte et assez large, centrée à 425 nm, car cette nanoparticule était bien dispersée, sans agrégation. L’apparition de cette bande, attribuée à un plasmon de surface, est bien documentée pour diverses nanoparticules métalliques dont la taille varie de 2 à 100 nm (El-Raheem et al., 2011). La SEM a montré la formation de nanoparticules d’argent d’une taille moyenne de 35 à 40 nm avec une distance interparticulaire. La forme des Ag-NPs s’est avérée sphérique. Ces résultats confirment la présence de liaisons amines primaires et secondaires ; de liaisons C=O, N=O, C=N et COOH de protéines, agissant comme agent de coiffage et de stabilisation à la surface des nanoparticules (Fatemeh et Bahram, 2012 ; Ramezani et al., 2012).

Le développement d’un procédé fiable et écologique pour la synthèse de nanoparticules métalliques est une étape importante dans le domaine des applications des nanotechnologies. Les méthodes de synthèse chimique entraînent la présence de produits chimiques toxiques adsorbés en surface, ce qui peut avoir un effet néfaste dans les applications médicales. La biosynthèse constitue un progrès par rapport aux méthodes chimiques et physiques, car elle est économique, respectueuse de l’environnement, facilement transposable à grande échelle pour une synthèse à grande échelle, et cette méthode ne nécessite ni haute pression, ni énergie, ni température élevée, ni produits chimiques toxiques. Il existe donc un grand besoin de nanoparticules d’argent synthétisées par des méthodes biologiques à base d’extraits de plantes plutôt que par d’autres méthodes toxiques (Singh et al., 2010 ; Jain et al., 2009 ; Vyom et al., 2009). La présente étude a confirmé que L. tropica est capable de produire des nanoparticules d’argent en 3 h, contrairement à d’autres chercheurs qui ont constaté que le principal problème des nanoparticules biologiques est la lenteur de leur production (Narayanan et Sakthivel, 2010). Cette approche de la synthèse de nanoparticules d’argent présente de nombreux avantages, tels que la montée en échelle du procédé, la viabilité économique et un mode de production sûr des nanoparticules. Les maladies parasitaires (comme le paludisme, la leishmaniose, la trypanosomiase) sont des problèmes de santé majeurs dans le monde entier (Edward et Krishna, 2004). La chimiothérapie antiparasitaire est le seul choix de traitement de ces infections parasitaires. La raison en est que ces infections ne provoquent pas de réponse immunitaire prononcée, de sorte qu’une vaccination efficace pourrait ne pas être possible (Watkins, 2003).

La principale raison de l’utilisation des Ag-NPs dans cette étude était leur capacité à produire des espèces réactives de l’oxygène (ROS), auxquelles les parasites Leishmania sont connus pour être sensibles. Des études récentes ont montré que leur grande surface spécifique, leur petite taille et leur capacité à se lier aux groupes contenant du soufre et du phosphore pourraient accroître leurs effets antileishmaniens. Il a été observé que les Ag-NPs diminuaient l’activité métabolique et les valeurs de prolifération des parasites par rapport aux groupes témoins (Allahverdiyev et al., 2011). Cette nanoparticule inorganique présente un net avantage sur les agents antimicrobiens chimiques conventionnels. Le problème le plus important causé par les agents antimicrobiens chimiques est la multirésistance aux médicaments. Il est donc cruellement nécessaire de trouver un moyen de surmonter la résistance aux médicaments de divers micro-organismes, notamment dans les dispositifs médicaux, etc. Les ions Ag sont utilisés depuis des décennies comme agent antimicrobien dans divers domaines en raison de leur capacité à inhiber la croissance des micro-organismes (Kim et al., 2007). Nos résultats concordent avec ceux obtenus dans différentes régions du monde (Allahverdiyev et al., 2011 ; Singh et al., 2010 ; Kim et al., 2007) et divergent de ceux d’autres auteurs (Narayanan et al., 2010 ; Sondi et Salopek-Sondi, 2004). Les nanoparticules ont d’abord été caractérisées par spectroscopie UV-vis, qui s’est révélée être une technique très utile pour l’analyse des nanoparticules.

La réduction des ions argent et la formation de nanoparticules stables sont apparues rapidement, en 3 h de réaction, ce qui en fait l’une des méthodes de bioréduction les plus rapides pour produire des nanoparticules d’argent (Kim et al., 2007). La réduction des ions argent présents dans la solution aqueuse de complexe d’argent lors de la réaction avec la culture cellulaire de L. tropica, observée par spectroscopie UV-Vis, a révélé la présence de nanoparticules d’argent, qui peut être corrélée aux spectres UV-Vis. La spectroscopie UV-Vis est bien connue pour étudier la forme et la taille des nanoparticules. L’analyse par microscopie électronique à balayage a confirmé la bioréduction des ions Ag+ en nanoparticules d’argent, et les dimensions morphologiques des Ag-NPs ont montré qu’elles mesuraient entre 35 et 40 nm avec une distance interparticulaire et qu’elles avaient une forme sphérique irrégulière. Ces résultats concordent avec ceux d’autres chercheurs (Fatemeh et Bahram, 2012 ; Ramezani et al., 2012 ; Ponarulselvam et al., 2012). Cette étude a conclu que l’efficacité de L. tropica pour la synthèse de nanoparticules d’argent s’est révélée supérieure ; cette méthode était en outre économique et facilement transposable à grande échelle pour une synthèse à grande échelle.

Rédigé par le Prof. Dr Abdulsada A. Rahi et la Dr Magda A. Ali (département de biologie, faculté des sciences, université de Wasit, Irak)