SmartPE dope l'édition de précision chez les cultures dicotylédones

Des matrices modifiées s'attaquent au goulot d'étranglement des dicotylédones

L'édition de précision (prime editing) permet aux chercheurs d'introduire des substitutions de bases, de petites insertions et délétions sans créer de cassures double brin de l'ADN ni nécessiter de matrices donneuses. L'invention limite les insertions et sous-produits non intentionnels, mais ses performances chez les cultures dicotylédones sont restées obstinément faibles et irrégulières selon les locus génomiques.

Pour augmenter les niveaux d'expression de la machinerie d'édition, une équipe dirigée par la professeure Gao Caixia, de l'Institut de génétique et de biologie du développement de l'Académie chinoise des sciences, a d'abord testé des séquences régulatrices placées entre le promoteur et la séquence Cas9. Selon Phys.org, l'insertion d'une séquence cis-régulatrice connue sous le nom d'élément START a multiplié par 2,1 les niveaux de transcrits et augmenté d'environ 1,8 fois les taux d'édition sur quatre sites test chez Arabidopsis.

Une conception d'ARN guides d'édition de précision appariés a ensuite été testée, mais les ARN guides appariés seuls n'ont pas suffi à améliorer l'efficacité. Les chercheurs ont supposé qu'un appariement complémentaire étroit entre la matrice de transcriptase inverse et l'ADN génomique entravait la progression de l'enzyme, tandis que les voies cellulaires de réparation des mésappariements supprimaient les éditions. L'équipe a donc introduit des mésappariements de bases intentionnels dans les matrices de transcriptase inverse des deux ARN guides, une innovation technique qui a multiplié par plus de six l'activité d'édition moyenne sur quatre sites cibles, pour atteindre environ 10 %.

L'architecture de la matrice régit la transcription inverse

L'équipe de recherche a cartographié systématiquement la manière dont l'espacement et la position des mésappariements introduits modifiaient les résultats d'édition. Les tests ont révélé que des mésappariements continus ou espacés de 3 pb offraient les meilleures performances, atteignant des efficacités allant jusqu'à 20 %, comme le rapporte Phys.org. Lorsque la distance entre les mésappariements passait à 6 paires de bases ou plus, les taux d'édition s'effondraient.

La position déterminait aussi le résultat. Placer des bases mésappariées aux deux bords de la fenêtre d'édition améliorait l'initiation de la transcription inverse, tandis qu'un placement directement au milieu n'apportait aucun bénéfice. Des tests sur des lignées cellulaires humaines ont révélé que l'inhibition de la voie de réparation des mésappariements ne modifiait pas les résultats de SmartPE de la même manière qu'elle changeait l'édition standard à guide unique, ce qui indique que le système à double guide repose sur d'autres voies cellulaires de réparation.

Modifications ciblées des cultures et limites d'insertion

Les chercheurs ont validé l'outil dans des protoplastes de cultures. Six cibles sur neuf chez la tomate ont dépassé 10 % d'efficacité d'édition, neuf cibles sur onze chez le soja ont franchi les 5 %, et cinq cibles chez le colza ont atteint ou dépassé 10 %, sur des locus où les éditeurs de précision classiques étaient presque inactifs. En intégrant des changements de codons synonymes pour produire les mésappariements de matrice requis, l'équipe a installé des changements d'un seul acide aminé dans des cibles de soja et de tomate avec des efficacités de 1,6 à 11,1 fois supérieures aux méthodes standard.

Dans des expériences de transformation stable sur des racines chevelues de tomate au locus SlOR2, SmartPE a produit 7,3 % d'éditions homozygotes et 12,5 % d'éditions hétérozygotes, alors que l'édition de précision classique ne donnait que des chimères et 1,0 % d'éditions hétérozygotes. Chez Arabidopsis et la tomate, la méthode a inséré avec succès des étiquettes protéiques, des amplificateurs et des sites de recombinaison à des taux allant jusqu'à 32 %. Chez le soja, en revanche, les transformations stables n'ont produit que des chimères, ce qui indique que d'autres transferts de technologie, développements de propriété intellectuelle et affinages de protocole restent nécessaires avant que l'outil puisse fournir de manière fiable des éditions stables dans toutes les cultures de légumineuses.

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