Synthèse verte et traitement par nanoparticules d'argent contre Leishmania major en Irak

Les leishmanioses sont un groupe de maladies parasitaires graves, infectieuses et non contagieuses, causées par des protozoaires du genre Leishmania. La transmission se fait lors du repas sanguin de phlébotomes femelles infectés du genre Phlebotomus, considérés comme les hôtes intermédiaires de ces parasites. La forme promastigote flagellée du parasite est présente chez le phlébotome et, une fois phagocytée par les macrophages de l'hôte, elle se transforme en forme amastigote aflagellée (1,2).

Les méthodes biologiques de synthèse de nanoparticules (NP) à l'aide de micro-organismes (3,4), d'enzymes (5), de champignons (6) et de plantes ou d'extraits de plantes (7,8) ont été proposées comme alternatives écologiques possibles aux méthodes chimiques et physiques. Le développement de procédés verts pour la synthèse de nanoparticules devient une branche importante des nanotechnologies, en particulier pour les nanoparticules d'argent, qui ont de nombreuses applications (9-11). Les méthodes de synthèse chimique conduisent à la présence de certains produits chimiques toxiques adsorbés en surface, qui peuvent avoir un effet indésirable dans les applications médicales. La synthèse verte présente un avantage sur les méthodes chimiques et physiques : elle est économique, respectueuse de l'environnement, facilement transposable à grande échelle et ne nécessite ni haute pression, ni énergie, ni température élevée, ni produits chimiques toxiques (12,13). Les nanoparticules d'argent jouent un rôle majeur en biologie et en médecine en raison de leurs propriétés physico-chimiques attrayantes. On sait depuis longtemps que les produits à base d'argent ont de forts effets inhibiteurs et bactéricides, ainsi qu'un large spectre d'activités antimicrobiennes, utilisés depuis des siècles pour prévenir et traiter diverses maladies, notamment les infections (14).

La taille des particules des NP joue un rôle important dans l'efficacité antimicrobienne (15) ; ainsi, l'effet le plus fort a été observé pour les NP de plus petite taille, davantage que pour celles de plus grande taille (16). La croissance de certains parasites tels que Giardia, Leishmania, Plasmodium, Toxoplasma et les larves d'insectes est inhibée par la présence de nanoparticules d'argent, d'or, de chitosane et de métaux oxydés (17).

Matériels et méthodes : Préparation des AgNPs-TA Un volume de 5 mL d'acide tannique (TA) a été ajouté à 5 mL d'AgNO 3 à 25 °C dans une fiole conique. Le mélange a été maintenu sous forte agitation magnétique pendant 5 heures, jusqu'à l'obtention d'une dispersion colloïdale brune d'AgNPs-TA, conservée à l'abri de la lumière jusqu'à son utilisation.

Caractérisation des nanoparticules Les spectres UV-Vis ont été enregistrés en mode absorbance (plage de 200 à 900 nm) avec un double faisceau pour vérifier la formation des nanoparticules. La taille, la forme et la morphologie des particules ont été évaluées par des images de microscopie électronique à balayage (MEB).

Préparation des promastigotes Des amastigotes de L. major isolés de lésions cutanées humaines ont été cultivés sur milieu Novy‐MacNeal‐Nicolle (NNN) contenant de l'agar (4 mg/100 ml) et du sang de lapin défibriné (10 %). Après la transformation des amastigotes en formes de type promastigote, la croissance des promastigotes s'est poursuivie dans un milieu de culture RPMI 1640 contenant 100 μg/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine, additionné de 10 % de sérum de veau fœtal (SVF) (Gibco Co.), dans un incubateur à 28 °C pendant deux semaines. Au cours de plusieurs passages, la suspension de parasites a été précipitée dans une centrifugeuse réfrigérée pendant 10 minutes à 4 500 tr/min, et le surnageant a été éliminé. Les parasites ont ainsi atteint une phase de croissance stable (phase stationnaire) après 12 jours et étaient prêts pour l'injection et l'induction de la LC (18, 19).

Groupes expérimentaux Les souris infectées par L. major ont été réparties au hasard en trois groupes de 10 souris chacun, comme suit :

Groupe 1 sans traitement, groupe témoin. Groupe 2, ayant reçu des AgNPs à la dose de 2 mg/kg sous anesthésie (20). Groupe 3, ayant reçu des AgNPs-TA à la dose de 2 mg/kg sous anesthésie.

Tous les traitements ci-dessus ont été administrés sur les lésions aux jours zéro, 4, 8 et 12.

Paramètres d'évaluation de l'efficacité du traitement L'efficacité des traitements a été enregistrée selon l'évolution de la lésion et de la charge parasitaire de la rate. La taille des lésions a été mesurée deux fois par semaine. Les souris ont été sacrifiées après le premier traitement et leur rate a été prélevée pour déterminer le nombre de parasites viables (21). Les rates des animaux ont été placées dans des plaques à 6 puits contenant du milieu RPMI‐1640 complet. Après homogénéisation du tissu splénique, le contenu de tous les puits a été complété à 200 microlitres avec du milieu RPMI‐1640 complet. Tous les échantillons ont été répartis en trois réplicats. Les plaques préparées ont été placées dans un incubateur à 28 °C pendant 10 jours. Enfin, les résultats positifs et négatifs ont été rapportés en dilutions en série sur la base des observations microscopiques.

Résultats et discussion : La mise au point d'un procédé fiable et écologique de synthèse de nanoparticules métalliques est une étape importante dans le domaine des applications des nanotechnologies. Avec les méthodes de synthèse chimique, certains produits chimiques toxiques adsorbés en surface peuvent avoir des effets secondaires dans les applications médicales. La synthèse verte est préférable aux méthodes chimiques et physiques car elle est économique, respectueuse de l'environnement, facilement transposable à grande échelle et ne nécessite ni haute pression, ni énergie, ni température élevée, ni produits chimiques toxiques. Ainsi, la production de nanoparticules d'argent par des méthodes biologiques à base d'extraits de plantes, plutôt que par d'autres méthodes toxiques, s'est révélée la meilleure et la plus efficace (22,23). Les bandes d'absorption de certaines nanoparticules métalliques dans la région du visible sont dues à l'oscillation collective des électrons en résonance avec le rayonnement électromagnétique incident, appelée bande de résonance plasmonique de surface (SPR) (24). Soixante échantillons de peau de patients suspectés de leishmaniose cutanée ont été examinés par observation microscopique à la recherche d'amastigotes de Leishmania ; 45 (75 %) se sont révélés positifs ; cependant, la culture NNN a conduit à la croissance de promastigotes dans 42 échantillons (70 %). Les résultats ont aussi montré que 54 échantillons (90 %) étaient positifs par PCR ; 60 % pour L. major et 30 % pour L. tropica.

Les cellules de Leishmania major exposées à des ions argent ont présenté une bande d'absorption UV–Vis distincte et assez large, centrée à 425 nm, car cette nanoparticule était bien dispersée, sans agrégation. L'apparition de cette bande, attribuée à un plasmon de surface, est bien documentée pour diverses nanoparticules métalliques dont la taille varie de 2 à 100 nm (25). Le MEB a montré la formation de nanoparticules d'argent d'une taille moyenne de 35 à 40 nm, avec une distance interparticulaire. Les spectres d'absorption UV-Vis se sont révélés très sensibles à la formation de colloïdes d'argent car les nanoparticules d'argent présentent un pic d'absorption intense dû à l'excitation du plasmon de surface (26,27).

L'apparence des parasites en présence d'AgNPs-TA suggère plusieurs mécanismes d'action possibles. La littérature antérieure rapporte que l'argent attaque la surface de la membrane cellulaire des bactéries, modifiant la perméabilité, l'équilibre osmotique et donc les voies métaboliques de la cellule. Les nanoparticules d'argent peuvent aussi se lier à l'ADN, empêchant la réplication (28-32). Les bandes SPR des nanoparticules d'or et d'argent revêtues de TA étaient décalées vers le rouge par rapport aux valeurs rapportées dans la littérature, soit 520 et 380-450 nm respectivement (33,34). Cet effet bathochrome est probablement dû à l'interaction supramoléculaire entre les nanoparticules et le polyphénol TA qui protège leur surface, modifiant l'énergie de transfert d'électrons. Outre la forme, la taille et le type de matériau, la position de la bande SPR dépend fortement de la constante diélectrique du milieu environnant, car celle-ci modifie la fréquence de résonance des électrons à la surface des NMNP (35-37).

Conclusions : Les nanoparticules d'argent synthétisées à l'aide d'acide tannique ont une application potentielle comme traitement antileishmanien. En outre, l'utilisation de composés naturels contribue au développement de méthodes propres, non toxiques, biocompatibles et respectueuses de l'environnement pour synthétiser des nanoparticules de métaux nobles.

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Abdulsada A. Rahi 1*, Magda A. Ali 2 et Zaid A. Abdulabbas (département de biologie, faculté des sciences, Université de Wasit, Kut, Irak.) (faculté de médecine, Université de Wasit, Kut, Irak)