Síntesis verde y tratamiento con nanopartículas de plata a partir de Leishmania major en Irak

Las leishmaniasis son un grupo de enfermedades parasitarias graves, infecciosas y no contagiosas, causadas por protozoos del género Leishmania. La transmisión se produce a través de la picadura de hembras infectadas de flebótomos del género Phlebotomus, que se consideran los hospedadores intermedios de estos parásitos. La forma promastigote flagelada del parásito está presente en el flebótomo y, una vez fagocitada por los macrófagos del hospedador, se transforma en la forma amastigote aflagelada (1,2).

Los métodos biológicos de síntesis de nanopartículas (NP) que emplean microorganismos (3,4), enzimas (5), hongos (6) y plantas o extractos vegetales (7,8) se han propuesto como posibles alternativas respetuosas con el medio ambiente frente a los métodos químicos y físicos. El desarrollo de procesos verdes para la síntesis de nanopartículas se está convirtiendo en una rama importante de la nanotecnología, especialmente en el caso de las nanopartículas de plata, que tienen numerosas aplicaciones (9-11). Los métodos de síntesis química dan lugar a la presencia de algunas sustancias químicas tóxicas adsorbidas en la superficie que pueden tener efectos adversos en las aplicaciones médicas. La síntesis verde supone un avance respecto a los métodos químicos y físicos, ya que es rentable, respetuosa con el medio ambiente y fácilmente escalable para la síntesis a gran escala, y con este método no es necesario emplear alta presión, energía, temperatura ni sustancias químicas tóxicas (12,13). Las nanopartículas de plata desempeñan un papel fundamental en el campo de la biología y la medicina gracias a sus atractivas propiedades fisicoquímicas. Desde hace tiempo se sabe que los productos de plata tienen fuertes efectos inhibidores y bactericidas, así como un amplio espectro de actividades antimicrobianas, que se han utilizado durante siglos para prevenir y tratar diversas enfermedades, sobre todo infecciones (14).

El tamaño de partícula de las NP desempeña un papel importante en la eficacia antimicrobiana (15), de modo que las NP de menor tamaño mostraron un efecto más fuerte que las de mayor tamaño (16). El crecimiento de algunos parásitos, como Giardia, Leishmania, Plasmodium, Toxoplasma y larvas de insectos, se inhibe en presencia de nanopartículas de plata, oro, quitosano y metales oxidados (17).

Materiales y métodos: Preparación de AgNPs-TA Se añadieron 5 mL de ácido tánico (TA) a 5 mL de AgNO 3 a 25 °C en un matraz cónico. La mezcla se mantuvo bajo fuerte agitación magnética durante 5 horas, hasta que se observó una dispersión coloidal marrón de AgNPs-TA, y se conservó al abrigo de la luz hasta su uso.

Caracterización de las nanopartículas Los espectros UV-Vis se registraron en modo de absorbancia (rango de 200-900 nm) con doble haz para comprobar la formación de nanopartículas. El tamaño, la forma y la morfología de las partículas se evaluaron mediante imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM).

Preparación de promastigotes Los amastigotes de L. major, aislados de lesiones cutáneas humanas, se cultivaron en medio Novy‐MacNeal‐Nicolle (NNN) con agar (4 mg/100 ml) y sangre de conejo desfibrinada (10 %). Tras la transformación de los amastigotes en formas similares a promastigotes, el crecimiento de los promastigotes continuó en medio de cultivo RPMI 1640 con 100 μg/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina, suplementado con un 10 % de suero fetal bovino (FCS) (Gibco Co.), en una incubadora a 28 °C durante dos semanas. Durante varios pases, la suspensión de parásitos se precipitó en una centrífuga refrigerada durante 10 minutos a 4500 rpm y se retiró el sobrenadante. Así, los parásitos alcanzaron una fase de crecimiento constante (fase estacionaria) a los 12 días y quedaron listos para la inyección e inducción de la LC (18, 19).

Grupos experimentales Los ratones infectados con L. major se dividieron aleatoriamente en tres grupos, cada uno de 10 ratones, del siguiente modo:

Grupo 1, sin tratamiento, fue el grupo de control. Grupo 2, recibió AgNPs a una dosis de 2 mg/kg bajo anestesia (20). Grupo 3, recibió AgNPs-TA a una dosis de 2 mg/kg bajo anestesia.

Todos los tratamientos anteriores se administraron en las lesiones los días cero, 4, 8 y 12.

Parámetros para evaluar la eficacia del tratamiento La eficacia de los tratamientos se registró según los cambios en la lesión y en la carga parasitaria del bazo. El tamaño de las lesiones se midió dos veces por semana. Los ratones fueron sacrificados tras el primer tratamiento y se les extrajo el bazo para determinar el número de parásitos viables (21). Los bazos de los animales se colocaron en placas de 6 pocillos con medio RPMI‐1640 completo. Tras homogeneizar el tejido del bazo, el contenido de todos los pocillos se completó hasta 200 microlitros con medio RPMI‐1640 completo. Todas las muestras se dividieron en tres réplicas. Las placas preparadas se pusieron en una incubadora a 28 °C durante 10 días. Por último, se registraron los resultados positivos y negativos en diluciones seriadas sobre la base de las observaciones microscópicas.

Resultados y discusión: El desarrollo de un proceso fiable y respetuoso con el medio ambiente para la síntesis de nanopartículas metálicas es un paso importante en el campo de las aplicaciones de la nanotecnología. Cuando se utilizan métodos de síntesis química, algunos materiales químicos tóxicos quedan adsorbidos en la superficie y pueden tener efectos secundarios en las aplicaciones médicas. La síntesis verde se prefiere a los métodos químicos y físicos, ya que es rentable, respetuosa con el medio ambiente y fácilmente escalable para la síntesis a gran escala, y con este método no es necesario emplear alta presión, energía, temperatura ni sustancias químicas tóxicas. Por ello, la producción de nanopartículas de plata mediante métodos biológicos basados en extractos vegetales, en lugar de otros métodos tóxicos, fue la mejor y más eficaz (22,23). Las bandas de absorción de algunas nanopartículas metálicas en la región visible se debieron a la oscilación colectiva de los electrones en resonancia con la radiación electromagnética incidente, denominada banda de resonancia de plasmón superficial (SPR) (24). Se analizaron sesenta muestras de piel de pacientes con sospecha de leishmaniasis cutánea para detectar amastigotes de Leishmania mediante observación microscópica, de las cuales 45 (75 %) fueron positivas; sin embargo, el cultivo en NNN permitió el crecimiento de promastigotes en 42 muestras (70 %). Además, los resultados mostraron que 54 muestras (90 %) fueron positivas por el método PCR; un 60 % L. major y un 30 % L. tropica.

Las células de Leishmania major expuestas a iones de plata mostraron una banda de absorción UV–Vis diferenciada y bastante ancha, centrada en 425 nm, porque esta nanopartícula estaba bien dispersa y sin agregación. La aparición de esta banda, que se asignó a un plasmón superficial, está bien documentada en diversas nanopartículas metálicas con tamaños que van de 2 a 100 nm (25). El SEM mostró la formación de nanopartículas de plata con un tamaño medio de 35 a 40 nm y con distancia entre partículas. Se ha demostrado que los espectros de absorción UV-Vis son bastante sensibles a la formación de coloides de plata, porque las nanopartículas de plata presentan un intenso pico de absorción debido a la excitación del plasmón superficial (26,27).

La aparición de parásitos en presencia de AgNPs-TA sugiere algunos posibles mecanismos de acción. La bibliografía previa indica que la plata ataca la superficie de la membrana celular de las bacterias, alterando la permeabilidad, el equilibrio osmótico y, por tanto, las vías metabólicas de la célula. Las nanopartículas de plata también pueden unirse al ADN e impedir su replicación (28-32). Las bandas SPR de las nanopartículas de oro y plata recubiertas de TA se desplazaron hacia el rojo en comparación con los valores indicados en la bibliografía, 520 y 380-450 nm, respectivamente (33,34). Este efecto batocrómico se debe probablemente a la interacción supramolecular entre las nanopartículas y el polifenol TA que protege su superficie, que altera la energía de transferencia de electrones. Además de la forma, el tamaño y el tipo de material, la posición de la banda SPR depende en gran medida de la constante dieléctrica del medio circundante, ya que modifica la frecuencia de resonancia de los electrones en la superficie de las NMNP (35-37).

Conclusiones: Las nanopartículas de plata sintetizadas con ácido tánico tienen una posible aplicación como tratamiento antileishmaniásico. Además, el uso de compuestos naturales conlleva el desarrollo de métodos limpios, no tóxicos, biocompatibles y benignos para el medio ambiente para sintetizar nanopartículas de metales nobles.

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Abdulsada A. Rahi 1*, Magda A. Ali 2 y Zaid A. Abdulabbas (Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de Wasit, Kut, Irak.) (Facultad de Medicina, Universidad de Wasit, Kut, Irak)