Biosintesi di nanoparticelle d’argento da parte di Leishmania tropica

La leishmaniosi è una malattia parassitaria causata da 20 diverse specie di Leishmania. La leishmaniosi è segnalata in 88 Paesi e si stima che 350 milioni di persone nel mondo siano a rischio di contrarre una forma della malattia e che 12 milioni siano infette, con un tasso di incidenza annuo di circa 1,5-2 milioni. Secondo le stime dell’OMS, il 90% dei casi cutanei si verifica in sei Paesi. La leishmaniosi, a seconda dell’agente causale e del background genetico dell’ospite, presenta varie manifestazioni, che vanno da una lesione che guarisce spontaneamente a una forma sistemica letale della malattia. Le due forme cliniche più comuni, la leishmaniosi cutanea (CL) e la leishmaniosi viscerale (VL), si osservano principalmente in 14 dei 22 Paesi della Regione del Mediterraneo orientale (EMRO) (Postigo, 2010). Tradizionalmente i parassiti Leishmania vengono rilevati direttamente mediante esame microscopico di campioni clinici. Tuttavia, in un’area endemica la CL può generalmente essere diagnosticata dal solo aspetto clinico (Kaur et al., 2003). La nanotecnologia è lo studio del controllo della materia su scala atomica e molecolare. In generale riguarda strutture di dimensioni pari o inferiori a 100 nm in almeno una dimensione e comporta lo sviluppo di materiali o dispositivi entro quelle dimensioni (Kim et al., 2010). I metodi biologici di sintesi delle nanoparticelle che utilizzano microrganismi (Klaus et al., 1999; Konishi e Uruga, 2007), enzimi (Willner et al., 2006), funghi (Vigneshwaran et al., 2007) e piante o estratti vegetali (Shankar et al., 2004; Ahmad et al., 2011) sono stati proposti come possibili alternative ecologiche ai metodi chimici e fisici. Lo sviluppo di processi verdi per la sintesi di nanoparticelle si sta evolvendo in un importante ramo delle nanotecnologie, in particolare per le nanoparticelle d’argento, che hanno molte applicazioni (Armendariz et al., 2002; Kim et al., 2010; Kyriacou et al., 2004). I metodi di sintesi chimica comportano la presenza di sostanze chimiche tossiche adsorbite sulla superficie, che possono avere effetti negativi nelle applicazioni mediche.

La sintesi verde rappresenta un progresso rispetto ai metodi chimici e fisici perché è economica, rispettosa dell’ambiente, facilmente scalabile per la sintesi su larga scala e, con questo metodo, non è necessario usare alta pressione, energia, temperatura e sostanze chimiche tossiche (Singh et al., 2010; Jain et al., 2009).

Negli ultimi anni le nanoparticelle d’argento (Ag-NP) hanno attirato notevole attenzione per le applicazioni mediche e chimiche grazie alle loro proprietà eccezionali, tra cui l’attività antibatterica, l’elevata resistenza all’ossidazione e l’elevata conducibilità termica (Feng et al., 2006; Lee, 2007; Soni e Prakash, 2011). Di recente, alcuni risultati hanno dimostrato che il nanoargento ha effetti antinfiammatori e favorisce la guarigione e la medicazione delle ferite. Se questi risultati saranno confermati in vivo, il nanoargento potrebbe essere adatto al trattamento delle ulcere (Karla et al., 2010).

Lo scopo del presente studio era valutare la sintesi di nanoparticelle d’argento utilizzando Leishmania tropica e determinare le caratteristiche del materiale prodotto. Questo studio è la prima documentazione della biosintesi di nanoparticelle d’argento da parte di L. tropica in Iraq.

MATERIALI E METODI

Raccolta dei campioni

Sono stati selezionati quarantaquattro (44) pazienti per l’isolamento di specie di Leishmania dalle loro colture. Sono stati prelevati raschiati cutanei dalla lesione e preparati strisci su vetrino, colorati con Giemsa ed esaminati al microscopio per verificare la presenza di amastigoti. La contaminazione batterica delle colture di Leishmania è stata ridotta al minimo pulendo le lesioni con metanolo al 70% ed eseguendo uno sbrigliamento locale prima di prelevare i campioni. Per ciascun paziente sono stati preparati almeno due vetrini colorati con Giemsa per l’esame microscopico e la coltura.

Coltura

I campioni sono stati aspirati dal bordo delle lesioni cutanee e coltivati in fase liquida (soluzione fisiologica) di terreno Novy MacNeal Nicolle (NNN). La coltura è stata incubata a 25°C e controllata per 28 giorni per verificare la crescita dei promastigoti di Leishmania. Penicillina-G e streptomicina sono state aggiunte alla soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) utilizzata nella coltura nel terreno NNN (Eisenberger e Jaffe, 1999; Farahmand et al., 2008).

PCR

Il saggio PCR è stato eseguito secondo il protocollo del produttore (Sinagen, Iran) con un volume finale di 25 μL per ciascuna reazione PCR. L’amplificazione PCR è stata effettuata in un termociclatore per DNA (Master cycler gradient, San Leonardo, Canada) alle seguenti condizioni: denaturazione iniziale (95°C, 3 min; 63°C, 30 s; 72°C, 60 s) 1 ciclo, seguita da 35 cicli comprendenti denaturazione (93°C, 20 s), appaiamento (63°C, 20 s) ed estensione (72°C, 40 s). Infine, 10 μL di campioni amplificati, senza aggiunta di tampone di caricamento, sono stati caricati in un gel di agarosio al 2% contenente 0,5 mg/ml di bromuro di etidio per l’elettroforesi e i prodotti sono stati visualizzati mediante transilluminazione ultravioletta (UV).

Sintesi delle Ag-NP

La coltura cellulare di L. tropica è stata mantenuta in agitazione (5.000 rpm) (5 g) per 5 min a 28°C fino alla separazione dal brodo di coltura; le cellule sedimentate sono state quindi lavate tre volte con acqua distillata. Un grammo (1 g) di massa cellulare umida è stato poi risospeso separatamente in una soluzione di AgNO3 0,001 M a pH da 5,4 a 6,0. L’intera miscela è stata lasciata a temperatura ambiente (25°C) per 3 h e la reazione ha avuto luogo. Per la caratterizzazione, le polveri di nanoparticelle sono state diluite in acetone puro e la sospensione preparata è stata sottoposta a ultrasuoni. La biotrasformazione è stata monitorata regolarmente mediante osservazione visiva della biomassa e misurazione degli spettri UV–Vis delle cellule di Leishmania. La reazione positiva si manifesta con la formazione di un colore giallo-marrone del mezzo, dovuto alla riduzione degli ioni argento e alla produzione di nanoparticelle d’argento nel mezzo. Per la microscopia elettronica a scansione sono stati preparati griglie SEM prelevando una piccola quantità di polvere del campione su una griglia ricoperta di rame e asciugandola sotto una lampada. Le nanoparticelle d’argento sono apparse di forma sferica e di dimensione media da 35 a 40 nm, con distanza interparticellare.

RISULTATI E DISCUSSIONE

Diagnosi di L. tropica mediante PCR, coltura e microscopio

Su 44 pazienti, in 38 (86,4%) sono stati rilevati amastigoti di Leishmania all’osservazione microscopica, che sono quindi risultati positivi; tuttavia la coltura NNN ha portato alla crescita di promastigoti in 40 campioni (90,1%). Inoltre i risultati mostrano che tutti i 10 campioni sono risultati positivi (100%) al saggio PCR.

Spettroscopia UV–vis e SEM

• Le cellule di L. tropica esposte agli ioni argento hanno mostrato una banda di assorbimento UV–Vis netta e abbastanza ampia, centrata a 425 nm, perché questa nanoparticella era ben dispersa senza aggregazione. La comparsa di questa banda, attribuita a un plasmone di superficie, è ben documentata per varie nanoparticelle metalliche di dimensioni comprese tra 2 e 100 nm (El-Raheem et al., 2011). La SEM ha mostrato la formazione di nanoparticelle d’argento di dimensione media da 35 a 40 nm, con distanza interparticellare. La forma delle Ag-NP si è rivelata sferica. Questi risultati confermano la presenza di legami amminici primari e secondari e di legami C=O, N=O, C=N e COOH delle proteine come agente di rivestimento e stabilizzante sulla superficie delle nanoparticelle (Fatemeh e Bahram, 2012; Ramezani et al., 2012).

Lo sviluppo di un processo affidabile ed ecologico per la sintesi di nanoparticelle metalliche è un passo importante nel campo delle applicazioni delle nanotecnologie. I metodi di sintesi chimica comportano la presenza di sostanze chimiche tossiche adsorbite sulla superficie, che possono avere effetti negativi nelle applicazioni mediche. La biosintesi rappresenta un progresso rispetto ai metodi chimici e fisici perché è economica, rispettosa dell’ambiente, facilmente scalabile per la sintesi su larga scala e, con questo metodo, non è necessario usare alta pressione, energia, temperatura e sostanze chimiche tossiche. C’è quindi un grande bisogno di nanoparticelle d’argento sintetizzate con metodi biologici, a base di estratti vegetali, al posto di altri metodi tossici (Singh et al., 2010; Jain et al., 2009; Vyom et al., 2009). Il presente studio ha confermato che L. tropica è in grado di produrre nanoparticelle d’argento entro 3 h, a differenza di altri ricercatori che hanno rilevato che il problema principale delle nanoparticelle biologiche è la lentezza della produzione (Narayanan e Sakthivel, 2010). Questo approccio alla sintesi di nanoparticelle d’argento presenta molti vantaggi, come la scalabilità del processo, la sostenibilità economica e un modo sicuro di produrre nanoparticelle. Le malattie parassitarie (come malaria, leishmaniosi, tripanosomiasi) sono gravi problemi sanitari in tutto il mondo (Edward e Krishna, 2004). La chemioterapia antiparassitaria è l’unica scelta per il trattamento di queste infezioni parassitarie. Il motivo è che queste infezioni non suscitano una risposta immunitaria pronunciata, per cui una vaccinazione efficace potrebbe non essere possibile (Watkins, 2003).

Il motivo principale per cui in questo studio sono state usate le Ag-NP è stata la loro capacità di produrre specie reattive dell’ossigeno (ROS), alle quali i parassiti Leishmania sono notoriamente sensibili. Studi recenti hanno mostrato che le loro ampie superfici, le piccole dimensioni e la capacità di legare gruppi contenenti zolfo e fosforo possono portare a un aumento dei loro effetti antileishmania. È stato osservato che le Ag-NP hanno ridotto i valori di attività metabolica e proliferazione dei parassiti rispetto ai gruppi di controllo (Allahverdiyev et al., 2011). Questa nanoparticella inorganica presenta un netto vantaggio rispetto ai tradizionali agenti antimicrobici chimici. Il problema più importante causato dagli agenti antimicrobici chimici è la resistenza multifarmaco. C’è quindi un disperato bisogno di un modo alternativo per superare la resistenza ai farmaci di vari microrganismi, soprattutto nei dispositivi medici e altrove. Gli ioni Ag sono stati utilizzati per decenni come agente antimicrobico in vari campi grazie alla loro capacità di inibire la crescita dei microrganismi (Kim et al., 2007). I nostri risultati concordano con altri risultati in diverse parti del mondo (Allahverdiyev et al., 2011; Singh et al., 2010; Kim et al., 2007) e sono in disaccordo con altri (Narayanan et al., 2010; Sondi e Salopek-Sondi, 2004). Le nanoparticelle sono state caratterizzate principalmente mediante spettroscopia UV-vis, che si è dimostrata una tecnica molto utile per l’analisi delle nanoparticelle.

La riduzione degli ioni argento e la formazione di nanoparticelle stabili sono comparse rapidamente, entro 3 h di reazione, il che ne fa uno dei metodi di bioriduzione più rapidi per produrre nanoparticelle d’argento (Kim et al., 2007). La riduzione degli ioni argento presenti nella soluzione acquosa del complesso d’argento durante la reazione con la coltura cellulare di L. tropica, osservata mediante spettroscopia UV-Vis, ha rivelato la presenza di nanoparticelle d’argento, che può essere correlata agli spettri UV-Vis. La spettroscopia UV-Vis è nota per indagare la forma e la dimensione delle nanoparticelle. L’analisi al microscopio elettronico a scansione ha confermato la bioriduzione degli ioni Ag+ a nanoparticelle d’argento, e le dimensioni morfologiche delle Ag-NP hanno dimostrato che sono comprese tra 35 e 40 nm, con distanza interparticellare, e che hanno una forma sferica irregolare. Questi risultati concordano con quelli di altri ricercatori (Fatemeh e Bahram, 2012; Ramezani et al., 2012; Ponarulselvam et al., 2012). Lo studio ha concluso che l’efficienza di L. tropica nella sintesi di nanoparticelle d’argento è risultata elevata; inoltre questo metodo è economico e facilmente scalabile per la sintesi su larga scala.

Scritto da prof. dott. Abdulsada A. Rahi e dott.ssa Magda A. Ali (Department of Biology, College of Science, Wasit University, Iraq)