SmartPE migliora il prime editing nelle colture dicotiledoni
Ricercatori dell'Accademia cinese delle scienze riprogettano le guide RNA per raggiungere un'efficienza di editing fino al 20 per cento in pomodori e soia.
Di Letizia Giugliano
3 min di letturaHuman-Edited, AI-Assisted
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I biologi molecolari hanno faticato ad adattare il prime editing alle piante a foglia larga, perché i tassi di editing nelle specie dicotiledoni restano abitualmente inferiori a quelli delle graminacee. Per superare questo ostacolo, i ricercatori dell'Accademia cinese delle scienze hanno sviluppato un sistema di prime editing ingegnerizzato chiamato SmartPE. L'invenzione biologica, pubblicata su Nature Plants, aumenta i tassi di modifica del bersaglio nei tessuti di pomodoro, soia e colza.
Template ingegnerizzati affrontano il collo di bottiglia dell'efficienza nelle dicotiledoni
Il prime editing consente ai ricercatori di introdurre sostituzioni di basi, piccole inserzioni e delezioni senza creare rotture a doppio filamento del DNA né richiedere template donatori. L'invenzione riduce al minimo inserzioni indesiderate e sottoprodotti, ma le sue prestazioni nelle colture dicotiledoni sono rimaste ostinatamente basse e irregolari tra i diversi loci genomici.
Per aumentare i livelli di espressione del macchinario di editing, un team guidato dalla professoressa Gao Caixia presso l'Istituto di genetica e biologia dello sviluppo dell'Accademia cinese delle scienze ha dapprima testato sequenze regolatorie inserite tra il promotore e la sequenza Cas9. Secondo Phys.org, l'inserimento di una sequenza cis-regolatoria nota come elemento START ha aumentato i livelli di trascritto di 2,1 volte e ha elevato i tassi di editing in quattro siti di prova di Arabidopsis di circa 1,8 volte.
È stata poi testata una progettazione con guide RNA appaiate per il prime editing, ma le sole guide RNA appaiate non sono riuscite ad aumentare l'efficienza. I ricercatori hanno ipotizzato che l'appaiamento complementare stretto tra il template della trascrittasi inversa e il DNA genomico ostacolasse l'avanzamento dell'enzima, mentre le vie cellulari di riparazione dei mismatch sopprimessero le modifiche. Il team ha quindi introdotto appositi mismatch di basi nei template della trascrittasi inversa di entrambe le guide RNA, un'innovazione tecnica che ha più che sestuplicato l'attività media di editing in quattro siti bersaglio, portandola a circa il 10%.
L'architettura del template governa la trascrizione inversa
Il gruppo di ricerca ha mappato sistematicamente come la spaziatura e la posizione dei mismatch introdotti modificassero gli esiti dell'editing. I test hanno rivelato che i mismatch continui o quelli distanziati di 3 bp offrivano le prestazioni migliori, raggiungendo efficienze fino al 20%, come riportato da Phys.org. Quando la distanza tra i mismatch aumentava a 6 paia di basi o più, i tassi di editing crollavano.
Anche la posizione determinava l'esito. Collocare le basi non appaiate su entrambi i margini della finestra di editing migliorava l'inizio della trascrizione inversa, mentre posizionarle direttamente al centro non produceva alcun beneficio. Test su linee cellulari umane hanno rivelato che inibire la via di riparazione dei mismatch non alterava gli esiti di SmartPE allo stesso modo in cui modificava l'editing standard con guida singola, indicando che il sistema a doppia guida si affida a vie cellulari di riparazione alternative.
Modifiche mirate delle colture e limiti delle inserzioni
I ricercatori hanno validato lo strumento nei protoplasti delle colture. Sei bersagli su nove nel pomodoro hanno superato il 10% di efficienza di editing, nove bersagli su 11 nella soia hanno superato il 5%, e cinque bersagli nella colza hanno raggiunto o superato il 10%, in loci dove i prime editor convenzionali erano quasi inattivi. Introducendo cambiamenti sinonimi di codone per produrre i mismatch richiesti nel template, il team ha inserito cambiamenti di singoli amminoacidi nei bersagli di soia e pomodoro con efficienze da 1,6 a 11,1 volte superiori ai metodi standard.
In esperimenti di trasformazione stabile su radici pelose di pomodoro al locus SlOR2, SmartPE ha prodotto modifiche omozigoti nel 7,3% dei casi ed eterozigoti nel 12,5%, mentre il prime editing convenzionale ha generato solo chimere e modifiche eterozigoti nell'1,0% dei casi. In Arabidopsis e nel pomodoro, il metodo ha inserito con successo tag proteici, enhancer e siti di ricombinazione con tassi fino al 32%. Nella soia, tuttavia, le trasformazioni stabili hanno prodotto solo chimere, indicando che ulteriori trasferimenti tecnologici, sviluppo di proprietà intellettuale e affinamento dei protocolli restano necessari prima che lo strumento possa fornire in modo affidabile modifiche stabili in tutte le colture di leguminose.
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