Sintesi verde e trattamento con nanoparticelle d’argento da Leishmania major in Iraq

Le leishmaniosi sono un gruppo di gravi malattie parassitarie infettive e non contagiose, causate da protozoi del genere Leishmania. La trasmissione avviene attraverso il pasto di sangue di femmine infette di flebotomi del genere Phlebotomus, considerati ospiti intermedi di questi parassiti. La forma promastigote flagellata del parassita è presente nel flebotomo e, una volta inglobata dai macrofagi dell’ospite, si trasforma nella forma amastigote priva di flagelli (1,2).

I metodi biologici di sintesi delle nanoparticelle (NP) che usano microrganismi (3,4), enzimi (5), funghi (6) e piante o estratti vegetali (7,8) sono stati proposti come possibili alternative ecologiche ai metodi chimici e fisici. Lo sviluppo di processi verdi per la sintesi di nanoparticelle si sta evolvendo in un importante ramo della nanotecnologia, in particolare per le nanoparticelle d’argento, che hanno molte applicazioni (9-11). I metodi di sintesi chimica portano alla presenza di alcune sostanze chimiche tossiche assorbite sulla superficie, che possono avere effetti negativi nelle applicazioni mediche. La sintesi verde rappresenta un progresso rispetto ai metodi chimici e fisici perché è economica, rispettosa dell’ambiente e facilmente scalabile per la sintesi su larga scala, e in questo metodo non è necessario usare alte pressioni, energia, temperature e sostanze chimiche tossiche (12,13). Le nanoparticelle d’argento svolgono un ruolo di primo piano in biologia e in medicina grazie alle loro interessanti proprietà fisico-chimiche. I prodotti a base d’argento sono noti da tempo per i loro forti effetti inibitori e battericidi, nonché per un ampio spettro di attività antimicrobiche, usati da secoli per prevenire e curare varie malattie, in particolare le infezioni (14).

La dimensione delle particelle delle NP svolge un ruolo importante nell’efficacia antimicrobica (15), per cui l’effetto più forte è stato mostrato dalle NP di dimensioni minori rispetto a quelle più grandi (16). La crescita di alcuni parassiti come Giardia, Leishmania, Plasmodium, Toxoplasma e di larve di insetti è inibita dalla presenza di nanoparticelle d’argento, d’oro, di chitosano e di metalli ossidati (17).

Materiali e metodi: Preparazione di AgNPs-TA Sono stati aggiunti 5 mL di acido tannico (TA) a 5 mL di AgNO 3 a 25 °C in una beuta conica. La miscela è stata mantenuta sotto forte agitazione magnetica per 5 ore, fino alla comparsa di una dispersione colloidale marrone di AgNPs-TA, e conservata al riparo dalla luce fino all’uso.

Caratterizzazione delle nanoparticelle Gli spettri UV-Vis sono stati registrati in modalità di assorbanza (intervallo 200-900 nm) con doppio fascio per verificare la formazione delle nanoparticelle. La dimensione, la forma e la morfologia delle particelle sono state valutate con immagini di microscopia elettronica a scansione (SEM).

Preparazione dei promastigoti Gli amastigoti di L. major, isolati da lesioni cutanee umane, sono stati coltivati su terreno Novy‐MacNeal‐Nicolle (NNN) contenente agar (4 mg/100 ml) e sangue di coniglio defibrinato (10%). Dopo la trasformazione degli amastigoti in forme simili ai promastigoti, la crescita dei promastigoti è proseguita in terreno di coltura RPMI 1640 contenente 100 μg/ml di penicillina e 100 μg/ml di streptomicina, integrato con il 10% di siero fetale di vitello (FCS) (Gibco Co.), in un incubatore a 28 °C per due settimane. Durante diversi passaggi la sospensione di parassiti è stata fatta precipitare in una centrifuga refrigerata per 10 minuti a 4500 giri/min, e il sovranatante è stato rimosso. In questo modo i parassiti hanno raggiunto una fase di crescita stabile (fase stazionaria) dopo 12 giorni e sono stati pronti per l’iniezione e l’induzione della leishmaniosi cutanea (CL) (18, 19).

Gruppi sperimentali I topi infettati con L. major sono stati divisi casualmente in tre gruppi, ciascuno composto da 10 topi, come segue:

Il gruppo 1, senza trattamento, era il gruppo di controllo. Il gruppo 2 ha ricevuto AgNPs alla dose di 2 mg/kg in anestesia (20). Il gruppo 3 ha ricevuto AgNPs-TA alla dose di 2 mg/kg in anestesia.

Tutti i trattamenti sopra descritti sono stati somministrati sulle lesioni nei giorni zero, 4, 8 e 12.

Parametri per valutare l’efficacia del trattamento L’efficacia dei trattamenti è stata registrata in base alle variazioni della lesione e della carica parassitaria nella milza. Le dimensioni delle lesioni sono state misurate due volte alla settimana. I topi sono stati sacrificati dopo il primo trattamento e ne è stata prelevata la milza per determinare il numero di parassiti vitali (21). Le milze degli animali sono state poste in piastre da 6 pozzetti contenenti terreno RPMI‐1640 completo. Dopo l’omogeneizzazione del tessuto splenico, il contenuto di tutti i pozzetti è stato portato a 200 microlitri con terreno RPMI‐1640 completo. Tutti i campioni sono stati divisi in tre repliche. Le piastre preparate sono state poste in incubatore a 28 °C per 10 giorni. Infine, i risultati positivi e negativi sono stati riportati in diluizioni seriali sulla base delle osservazioni al microscopio.

Risultati e discussione: Lo sviluppo di un processo affidabile ed ecologico per la sintesi di nanoparticelle metalliche è un passo importante nel campo delle applicazioni della nanotecnologia. Con i metodi di sintesi chimica, alcuni materiali chimici tossici assorbiti sulla superficie possono avere effetti collaterali nelle applicazioni mediche. La sintesi verde è preferibile ai metodi chimici e fisici perché è economica, rispettosa dell’ambiente e facilmente scalabile per la sintesi su larga scala, e in questo metodo non è necessario usare alte pressioni, energia, temperature e sostanze chimiche tossiche. Pertanto, la produzione di nanoparticelle d’argento con metodi biologici basati su estratti vegetali, al posto di altri metodi tossici, è stata la migliore e la più efficace (22,23). Le bande di assorbimento di alcune nanoparticelle metalliche nella regione del visibile sono state mostrate a causa dell’oscillazione collettiva degli elettroni in risonanza con la radiazione elettromagnetica incidente, detta banda di risonanza plasmonica di superficie (SPR) (24). Sessanta campioni cutanei di pazienti con sospetta leishmaniosi cutanea sono stati analizzati per la ricerca di amastigoti di Leishmania mediante osservazione al microscopio; 45 (75%) sono risultati positivi, mentre la coltura su NNN ha portato alla crescita di promastigoti in 42 campioni (70%). I risultati hanno inoltre mostrato che 54 campioni (90%) erano positivi con il metodo PCR; 60% L. major e 30% L. tropica.

Le cellule di Leishmania major esposte a ioni d’argento hanno mostrato una banda di assorbimento UV–Vis distinta e abbastanza ampia, centrata a 425 nm, perché queste nanoparticelle erano ben disperse, senza aggregazione. La comparsa di questa banda, attribuita a un plasmone di superficie, è ben documentata per varie nanoparticelle metalliche con dimensioni comprese tra 2 e 100 nm (25). Il SEM ha mostrato la formazione di nanoparticelle d’argento con una dimensione media da 35 a 40 nm, con una distanza interparticellare. Gli spettri di assorbimento UV-Vis si sono dimostrati piuttosto sensibili alla formazione di colloidi d’argento, perché le nanoparticelle d’argento mostrano un intenso picco di assorbimento dovuto all’eccitazione plasmonica di superficie (26,27).

La comparsa dei parassiti in presenza di AgNPs-TA suggerisce alcuni possibili meccanismi d’azione. La letteratura precedente riferisce che l’argento attacca la superficie della membrana cellulare dei batteri, alterandone la permeabilità, l’equilibrio osmotico e quindi le vie metaboliche della cellula. Le nanoparticelle d’argento possono anche legarsi al DNA, impedendone la replicazione (28-32). Le bande SPR delle nanoparticelle d’oro e d’argento rivestite con TA sono risultate spostate verso il rosso rispetto ai valori riportati in letteratura, rispettivamente 520 e 380-450 nm (33,34). Questo effetto batocromico è probabilmente causato dall’interazione supramolecolare tra le nanoparticelle e il polifenolo TA che ne protegge la superficie, che altera l’energia di trasferimento degli elettroni. Oltre che dalla forma, dalle dimensioni e dal tipo di materiale, la posizione della banda SPR dipende fortemente dalla costante dielettrica del mezzo circostante, poiché questa modifica la frequenza di risonanza degli elettroni sulla superficie delle NMNP (35-37).

Conclusioni: Le nanoparticelle d’argento sintetizzate con acido tannico hanno un potenziale utilizzo come trattamento antileishmaniale. Inoltre, l’uso di composti naturali favorisce lo sviluppo di metodi puliti, non tossici, biocompatibili e rispettosi dell’ambiente per sintetizzare nanoparticelle di metalli nobili.

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Abdulsada A. Rahi 1*, Magda A. Ali 2 e Zaid A. Abdulabbas (Dipartimento di Biologia, Facoltà di Scienze, Università di Wasit, Kut, Iraq.) (Facoltà di Medicina, Università di Wasit, Kut, Iraq)